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ISSN : 1229-1153(Print)
ISSN : 2465-9223(Online)
Journal of Food Hygiene and Safety Vol.30 No.3 pp.289-294
DOI : https://doi.org/10.13103/JFHS.2015.30.3.289

Development of Primer Sets for the Detection of Polygonum multiflorum, Cynanchum wilfordii and C. auriculatum

Kyu-Heon Kim, Yong-Sang Kim, Mi-Ra Kim, Ho-Yeon Lee, Kyu Ha Lee1, Jong Hwan Kim1, Rack Seon Seong, Tae Sun Kang*, Jin-Ha Lee, Young-Mi Jang
New Hazardous Substance Team, National Institute of Food and Drug Safety Evaluation, Ministry of Food and Drug Safety
1Herbal Medicine Research Division, National Institute of Food and Drug Safety Evaluation
*Correspondence to: Tae Sun Kang, New Hazardous Substance Team, Food Safety Evaluation Department, National Institute of Food and Drug Safety Evaluation, Ministry of Food and Drug Safety, 187 Osongsaengmyeong2-ro, Osong-eup, Heungdeok-gu, Cheongju-si, Chungcheongbuk-do 363-700, Korea Tel: 82-43-719-4454, Fax: 82-43-719-4450 E-mail: missa1976@gmail.com
April 6, 2015 June 10, 2015 July 24, 2015

Abstract

The aim of this study was to develop rapid screening method for the identification of Chinese herbal medicine species with similar appearance, Polygonum multiflorum, Cynanchum wilfordii and C. auriculatum, by using genetic markers. As a genetic marker, psbA-trnH gene in chloroplast was selected due to differences in sequence among the three species. Species-specific primers were designed based on the sequences of the marker gene of P. multiflorum, C. wilfordii, and C. auriculatum, and the expected size of PCR products was 160, 147, and 119 bp, respectively. Under the developed conditions, cross-reaction was not detected among these three plant species. To confirm the efficiency of our species-specific primers, the optimized method was applied to a variety of processed products composed of mostly P. multiflorum and C. wilfordii, demonstrating that our method was a rapid and easy screening assay. Our findings suggest this screening method can be utilized to prevent the distribution of economically motivated adulteration food and to improve consumer’s right.


유전자 마커를 이용한 하수오, 백수오 및 이엽우피소 종 판별법 개발

초록


    National Institute of Food and Drug Safety Evaluation
    15161불량식073

    중국의 중약대사전과 중약지(中藥志)에는 백수오 기원식 물(起源植物)로 은조롱 (격산소, Cynanchum wilfordii hemsley), 이엽우피소(耳葉牛皮消, C. auriculatum Royle ex Wight) 및 대근우피소(C. bungei Dence)가 수재되어 있으 나9,13,14), 우리나라의 「대한민국약전외한약(생약)규격집」에 는 기원식물로 은조롱만이 규정되어 있다. 우리나라에서 백수오로 널리 재배된 은조롱은 지주설치 비용과 노동력 이 많이 소요될 뿐만 아니라 생산성이 낮아 농가에서 재 배를 기피하여 왔는데13,14), 1990년대 초반에 수량성이 높 은 이엽우피소가 중국으로부터 도입되면서 대부분의 농가 에서 은조롱 대신 이엽우피소가 재배되고 있는 실정이다. 한국, 중국, 일본 및 북한의 약전 혹은 규격집에 수재된 하수오는 Polygonum multiflorum를 기원식물로 하며, 백수 오는 한국과 북한의 약전 혹은 규격집에 C. wilfordii를 기 원식물로 수록하고, 중국과 일본에서는 수재하고 있지 않 다. 이렇게 규정과 현실이 일치되지 않는 문제가 있어 이 를 해결하기 위한 연구가 절실히 요구되고 있다3,14). 또한 백수오는 하수오(P. multiflorum Thunberg)와 식물분류학적 위치와 유효성분이 서로 다름에도 불구하고 우리나라의 생약시장, 민간요법 및 임상에서 하수오라는 이름으로 혼 용됨으로써 큰 혼란이 야기되는 생약이다. 뿐만 아니라 백 수오(은조롱)와 이엽우피소는 박주가리(Metaplexis japonica Makino)와 성숙기의 열매와 종자가 매우 유사하여 생약에 관심을 갖는 이들에게 혼동을 야기시키므로 이들을 정확 히 구분할 수 있는 식별방법(識別方法) 개발이 필요하다. 백수오의 이명을 백하수오라 하여 하수오로 오용되기도 했으나 백수오와 하수오는 기원과 함유 성분이 전혀 다르 므로 혼동해서는 안 된다. 국내에 재배되고 있는 동속식 물 이엽우피소가 백수오로 혼입되어 유통되고 있으므로 주의해야 한다. 이엽우피소는 긴 원기둥 모양 혹은 방추 형이며 조금 구부러져 있는 것이 백수오와 형태가 매우 비슷하나12,14,21), 기원·성상 부적합에 따른 식품원료 불가 품목이며, 임신 중인 돼지가 이엽우피소 섭취 시 유산을 야기한다는 보고가 있어 U.S. FDA는 이엽우피소를 독성 식물로 분류하였다5)(FDA Poisonous Plant Database; http:/ /www.accessdata.fda. gov/scripts /Plantox /Detail.CFM?ID= 11513). 건강식품 및 보조제의 원료로 사용되는 하수오 및 백수오는 대근을 사용하므로 일반인이 이엽우피소와 구분 하기가 어려우며, 특히 분말이나 추출물 형태로 가공되기 때문에 혼입여부를 판별하는 것이 극히 어렵다. 식물의 종 을 정확하고 신속하게 판별하기 위해 외부 요소에 영향을 받지 않는 DNA 마커를 활용한 방법이 최근 주요 작물을 대상으로 활발히 연구되고 있다. DNA 마커를 이용한 방 법은 식물체의 모양과 크기 등 형태적 특성과 달리 외부 환경의 영향을 받지 않고 식물의 종을 구분할 수 있으며, 사용할 수 있는 마커 수의 제한이 없어 정확한 판별이 가 능하다9-11,14).

    분자생물학 및 유전자 분석 기술의 발달로 Polymerase Chain Reaction (PCR)을 통해 DNA 염기서열 차이를 이 용한 종 판별이 가능하게 되었다. 특히, 종 특이 프라이머 를 이용한 PCR법은 종간 판별은 물론 동종 내에서의 판 별이 가능한 방법으로 식품원료 진위 판별에 주로 이용되 고 있다16,23-25). 유전자는 모든 동·식물의 조직 내에 존재 하며 식품 제조·공정 중 처리되는 압력, 고열 등에 대한 안정성이 단백질 보다 비교적 높은 장점이 있다. 유전자 를 이용하는 방법 중 일반 프라이머를 이용하여 특정 유 전자 영역을 증폭한 후 염기서열 분석을 통해 정확한 종 판별하는 것이 가장 일반적인 방법이지만, 염기서열 분석 시간이 비교적 길고, 유전자은행과 같은 데이터베이스에 염기서열 정보가 등록되어 있지 않으면 정확한 시료 동정 이 어렵다. 또한 비교적 긴 주형 DNA를 요구하기 때문에 열로 인해 DNA 손상 가능성이 있는 열처리 가공식품에 서의 식품원료 종 판별에 한계가 있다. 최근 종 특이 프 라이머를 이용한 종 판별법에 대한 관심이 높아지고 있는 데, 특정 유전자 염기서열에만 반응하여 증폭시키는 프라 이머를 개발하여 식품 중 식물성 원료의 진위 여부를 판 단하는데 이용된다1,17,19,20,26,27).

    본 연구에서는 하수오, 백수오 및 이엽우피소의 종 판 별을 위하여 엽록체 내 psbA-trnH 유전자를 대상으로 종 특이적 프라이머를 개발하였고 최적의 PCR 조건을 확립 하였다. 또한, 개발된 판별법을 다양한 형태로 가공된 하 수오, 백수오 원료 및 제품에 적용하여 그 효율성을 확인 하였다.

    Materials and Methods

    시료 확보 및 전처리

    본 연구에서 사용된 하수오(P. multiflorum), 백수오(C. wilfordii) 및 이엽우피소(C. auriculatum) 3종은 식품의약 품안전평가원 생약연구과에서 제공받아 표준시료로 사용 하였으며, 프라이머의 적용 실험에 사용된 하수오 제품(4 종), 백수오 제품(5종)은 제품 형태별 무작위 선별 후 구 입하여 이용하였다. 표준시료를 이용하여 혼합 시 결과를 확인하기 위해 가루 형태의 백수오에 이엽우피소를 0%, 0.5%, 1%, 2%, 5%, 10%, 50% 비율(w/w)로 혼합하여 각 각의 유전자를 추출하였고, 제품 중 즙 형태의 경우 20,000 × g에서 5분간 원심분리하여 상등액을 제거한 후 침전물 만을 건조하여 시료로 사용하였다.

    유전자 추출

    유전자 추출은 DNeasy Plant mini kit (Qiagen GmbH, Hilden, Germany)를 사용하였고, 추출 방법은 제조사에서 제공하는 방법에 따라 추출하였다.

    유전자 단순 증폭

    시중에 판매되고 있는 백수오 및 하수오 제품을 대상으 로 본 연구에서 개발한 진위 판별법을 적용하기 위하여 유전자를 추출하였다. 하지만 가공 공정에 따른 가열 및 강압으로 DNA가 파괴 및 손실 됨에 따라 추출된 DNA양 이 0.1 ng/μl 이하로 PCR이 불가능 하였다. 따라서, PCR 로 증폭이 가능한 DNA 단편들의 양을 증가시키고, PCR 반응을 저해 할 수 있는 물질들의 비율을 감소시키기 위 해 유전자의 단순 증폭 실험을 추가 진행 하였다. 본 실 험에서는 유전자의 단순 증폭을 하기 위하여 Whole Genome Amplification kit (WGA, Sigma, USA)를 사용하였다. 실 험 방법은 제조사에서 제공하는 방법에 따라 증폭을 수행 하였고, 최종 증폭된 산물은 AccuPrep® PCR Purification Kit (Bioneer, Korea)를 이용하여 정제한 후 종 특이 프라 이머를 이용한 진위 판별 PCR실험에 사용하였다.

    종 특이 프라이머 설계

    종 특이 프라이머 설계를 위해 미국 국립보건원에서 운 영하는 유전자 은행에 등록되어 있는 하수오, 백수오 및 이엽우피소에 대한 엽록체와 핵 내 유전 정보를 확인하였 다. 유전자 은행에 유전 정보가 없는 백수오의 ITS유전자, 이엽우피소의 trnH-psbA유전자의 경우 일반 프라이머 (universal primer)를 이용하여 유전자를 증폭한 후 염기서 열을 결정하고 그 결과를 비교하여 종 특이 프라이머를 설계하였다. 설계한 프라이머는 바이오니아(Bioneer, Korea) 에 의뢰하여 합성하였다(Table 1).

    PCR 반응 및 결과 확인

    PCR을 위한 반응액의 조성은 추출한 주형 DNA 20~100 ng/μl, dNTPs 200 μM, MgCl2 2.0 mM 그리고 0.5 μM 의 정방향 및 역방향 프라이머 각각 1 μl를 혼합하였으며, 최 종 용량은 20 μl가 되도록 증류수를 첨가하였다. 유전자 증폭을 위해 Taq. DNA polymerase 및 dNTPs, MgCl2은 Takara사(Japan)에서 구매하였고, PCR 장비는 C1000 TouchTM Thermal Cycler (Bio-RAD Laboratories, Inc. USA)을 사용 하였다. 본 연구에서 개발된 종 특이 프라이머의 염기서 열 및 검출을 위한 최적의 PCR 반응조건은 Table 2에 나 타내었다. 또한 이엽우피소의 검출 한계를 확인 하기 위 하여 이엽우피소 DNA 20 ng/μl 를 10배 단위로 희석하여 PCR실험을 진행하였다. 최종 산물의 확인은 반응액 5 μl를 취하여 EtBr이 첨가된(1 μl/ml) 아가로즈 젤로 100 V, 30분 간 전기영동 하였다. PCR 산물의 크기 확인은 100 bp DNA ladder (Bioneer, Korea)를 사용하였으며, 전기영동 완료 후 UV 투영기를 이용하여 결과를 확인하였다.

    Results

    종 특이 프라이머 설계

    하수오, 백수오 및 이엽우피소의 종 특이 프라이머를 설 계하기 위하여 식물의 분자계통분류학적 연구에 유전자 마커로 주로 이용되고 있는 rbcL, psbA-trnH 그리고 ITS 등의 유전자 염기서열을 비교 하였다. 하지만 유전자 내 변이가 적은 rbcL, ITS의 경우 하수오와 백수오의 종간 구 분은 가능했지만, 백수오 및 이엽우피소와 같은 근연종의 경우 염기서열 차이가 적어 종 특이 프라이머 설계에 적 용하기가 어려웠다. 본 연구에서는 엽록체 유전자 중 종 간 염기서열 차이가 분명하여 하수오, 백수오 및 이엽우 피소의 구별이 가능한 psbA-trnH를 마커 유전자로 선택하 고 종 특이 프라이머를 설계하였다2,18,22,26). 또한 건강기능 식품 등과 같은 가공식품의 경우 고온, 강압 등의 단계를 거쳐 제조·가공되므로 가공 시 발생하는 DNA 절단 및 파괴 등의 손상을 고려하여 PCR 산물의 크기는 200 bp 내외가 되도록 프라이머를 설계하였고, 이를 이용하여 PCR 조건을 최적화 하였다(Table 1).

    PCR 조건 최적화 및 확인

    각각의 종 특이 프라이머를 사용하여 최적화 된 조건으 로 PCR을 수행한 결과, 하수오(P. multiflorum), 백수오(C. wilfordii), 이엽우피소(C. auriculatum)에서 각각 160, 147, 119 bp의 예상된 크기의 증폭 산물을 확인 할 수 있었고, 각각의 대상 종 이외의 비교 종에서 비 특이적 밴드는 생 성되지 않았다(Fig. 1). 또한, 백수오와 이엽우피소 혼합 실험에서는 2% 이상의 이엽우피소가 혼합 되었을 때 개 발된 종 특이 PCR방법으로 이엽우피소 유전자를 검출할 수 있었으며(Fig. 2), 최적화된 PCR 조건하에서 이엽우피 소의 검출 한계는 0.2 ng/μl 이었다.

    가공식품에 대한 적용

    하수오, 백수오 및 이엽우피소 종 특이 판별법의 가공 식품 적용성을 확인하기 위해 시중에 판매중인 가공식품 9건(하수오 제품 4건, 백수오 제품 5건)을 무작위 선별 후 구매하여 분석하였다. 제조공정 중 발생할 수 있는 고온 및 고압으로 인하여 소량의 유전자가 추출 되었으며(0.1 ng/ul 이하), 추출된 DNA 양은 제품의 유형(즙, 분말 등) 에 따라 차이가 있었다. 때문에 WGA kit를 이용하여 추 출된 DNA를 단순 증폭 후 종 특이 PCR실험에 사용하였 으며 결과를 Table 3에 정리하였다. 하수오 제품의 경우 즙 형태 및 분말형태에서 모두 하수오의 유전자가 확인 되었는데, 2개의 제품에서 백수오 유전자도 확인이 되었 다. 또한, 모든 백수오 제품에서 백수오 유전자가 확인 되 었으며 1개의 즙 형태 제품에서 하수오 유전자가 확인 되 었다. 반면, 모든 하수오 및 백수오 제품에서 이엽우피소 유전자는 확인되지 않았다. 본 연구를 통하여 개발된 종 특이 프라이머는 하수오, 백수오 및 이엽우피소의 원료 및 가공품을 대상으로 향상된 종 판별법을 보였으나, 정성분 석법의 한계상 일부 백수오 및 하수오 가공품에서 보여진 교차 확인 사례의 원인은 동일한 생산라인의 사용으로 인 한 비의도적 혼입인지 또는 단가를 절감하기 위한 의도적 혼합인지는 판단 할 수 없었다.

    Discussion

    언론을 통해 하수오 및 백수오의 효능이 소개되고 기능 성 생약으로서 관심이 높아지면서 하수오 및 백수오와 가 짜 백수오로 알려진 이엽우피소를 판별하기 위한 다양한 분석법이 개발 중에 있다. 유전자를 이용한 분자생물학적 종 판별 연구는 대표적인 분석방법으로, 선행 연구에서 하 수오, 백수오 및 이엽우피소의 종 판별을 위해 trnL (tRNALeu) 유전자를 마커로 한 multiplex-PCR기반의 분석법을 보 고한 바 있다15). Multiplex-PCR을 이용한 판별법은 생약 원물의 경우 손쉽게 하수오, 백수오 및 이엽우피소를 동 시에 검출할 수 있지만, 하수오, 백수오 및 이엽우피소 외 의 다양한 식품원료가 포함된 가공식품의 경우 정확한 종 판별이 어렵다는 한계가 있다. 종 특이 프라이머를 이용 한 분석법은 multiplex-PCR 기반의 방법이 가지고 있는 한계를 극복할 수 있는 하나의 대안이어서, 특정 유전자 염기서열에만 반응하여 증폭시키는 프라이머를 개발하여 식품 중 식물성 원료의 진위 여부를 판단하는데 이용되고 있다24,25).

    본 연구에서 개발된 하수오, 백수오 및 이엽우피소에 대 한 종 특이 프라이머는 육안으로 사용원료의 확인이 어려 운 가공식품 등을 대상으로 간단하고 정확하게 특정 사용 원료의 진위 여부를 확인할 수 있다. 또한 식품의 가공 중 발생 할 수 있는 유전자 손상을 고려하여, 최종 증폭 산 물의 크기를 200 bp 내외가 되도록 프라이머를 설계하였 으며, 이는 일반 프라이머가 가지고 있는 가공식품 적용 한계를 극복할 수 있을 것이라 판단된다. 하지만 본 연구 에서 개발한 유전자 분석법은 의도적/비의도적 혼입에 대 한 정확한 판단이 어렵다는 한계가 있어, 추후 종 특이 프 라이머를 이용한 정량분석법 개발 등의 보안이 필요하다. 따라서 이러한 사항이 보안되어 개발된 판별법을 활용한 다면, 건전한 식품제조업체를 보호하고 정확한 표시사항 준수를 통한 소비자 보호와 불량식품 근절에 적극 활용될 수 있을 것으로 사료된다.

    국문요약

    본 연구에서는 건강기능성 식품원료로서 이용 빈도가 증 가하고 있는 하수오, 백수오 및 이엽우피소에 대한 종 특 이 프라이머를 개발하였다. 개발된 종 특이 프라이머는 하 수오, 백수오 및 이엽우피소에 대해 원물뿐만 아니라 육 안 확인이 어려운 가공식품 등을 대상으로 사용원료의 진 위여부를 빠르고 정확하게 확인할 수 있었다. 따라서 본 연구에서 개발한 종 특이 PCR방법은 기존의 일반 프라이 머를 사용하는 방법이 가지고 있는 식품 적용 한계를 극 복할 수 있을 것이라고 판단하였다.

    Figure

    JFHS-30-289_F1.gif

    PCR results from various standard samples by PCR using Polygonum multiflorum, Cynanchum wilfordii and C. auriculatum specific primers. (A) Lane 1,2; P. multiflorum, Lane 3,4; C. wilfordii, Lane 5,6; C. auriculatum. (B) Lane 1,2; C. wilfordii, Lane 3,4; P. multiflorum, Lane 5,6; C. auriculatum. (C) Lane 1,2; C. auriculatum, Lane 3,4; P. multiflorum, Lane 5,6; C. wilfordii, Lane 7; Negative Control. M: Size marker.

    JFHS-30-289_F2.gif

    The PCR detection of C. auriculatum adulteration into C. wilfordii presented in ratio of 0%, 0.5%, 1%, 2%, 5%, 10%, 50% and 100% (A) C. wilfordii specific primer, (B) C. auriculatum specific primer(C. auriculatum adulterattion ratio 0% (Lane 1), 0.5% (Lane 2), 1% (Lane 3), 2% (Lane 4), 5% (Lane 5), 10% (Lane 6), 50% (Lane 7), 100% (Lane 8), Negative Control (Lane 9), Size marker (M).

    Table

    Information of species-specific primer used in this study

    Information of PCR condition used in this study

    The type of classified health functional food of purchased samples in markets and PCR results using Polygonum multiflorum, Cynanchum wilfordii, C. auriculatum specific primers

    1)Polygonum multiflorum,
    2)Cynanchum wilfordii
    3)C. auriculatumspecific primer.

    Reference

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