건강한 삶에 대한 욕구가 증대되어 건강기능식품의 개 발이 미래 식품산업의 주류로 급부상하고 있다. 건강기능 식품의 수요 증가와 함께 프로바이오틱스(probiotics)의 의 학식품, 약품으로서 이용 가능성이 제시되고 있다^1,2).

프로바이오틱스란 인간이나 동물 등 숙주의 건강에 유 익한 효과를 나타내는 미생물 또는 그 성분으로 균주 특 이적이며 같은 종과 속에 해당하는 균주라도 효능은 매우 다르다. 주로 치즈, 김치와 같은 식품 및 동물의 분변 등 에서 분리되며 최근에는 식물 유래 유산균에 대한 관심이 커지고 있다. 프로바이오틱스는 장 건강 등 일차적인 기 능성 외에도 면역증강, 대사증후군, 뇌건강 등 신체 전반 에 도움을 주는 기능성이 알려져 있다^3,4). 이 중 면역증강 에 대한 연구는 프로바이오틱스 섭취 또는 그 발효물에 의한 면역세포 및 장관면역 활성화가 보고 된 바 있다^5-7).

이러한 프로바이오틱스가 면역증강을 위해서는 유산균 이 소화기관을 거쳐 장내까지 생존하여야 하며 장내표면 이나 상피세포에 어떠한 형태로든 결합하여 지속적으로 살 아갈 수 있는 능력이 있어야한다. 하지만, 유산균은 섭취 후 위산에 의해 90% 이상이 사멸되고, 위산에 생존한 유 산균은 다시 담즙산에 의해 사멸되는 것으로 알려져 있다. 즉 유산균이 최종 목적지인 장(腸)에 도착할 확률은 5% 정도에 불과하다⁸⁾. 이를 개선하기 위해, 유산균 자체를 코 팅하는 기술과 배양시 탄산염, 계면활성제 및 폐배추와 같 은 천연물 추출액등 다양한 배지성분 활용하는 방법과 열 처리 방법을 달리하여 배양하는 방법에 대한 연구가 진행 되어지고 있다^9,10). 그 외에도 체내 안정성을 위해 프로바 이오틱스와 프리바이오틱스(prebiotics)의 조합인 신바이오 틱스(synbiotics)를 이용한 연구도 점차 증가하고 있다^11,12).

프리바이오틱스는 유익한 장내 미생물의 성장이나 활성 을 촉진함으로써, 숙주의 건강에 좋은 효과를 나타내는 소 화되지 않는 영양성분을 일컫는다. 대표적으로 올리고당, 키토산, 식이섬유 등이 다량 함유되어 있는 채소류 및 해 조류 등이 프리바이오틱스로 광범위하게 사용되어지고 있 다^4,13). 그 중, 해조류는 소화 흡수율이 낮아 영양학적인 측 면에서 관심을 끌지 못하였으나, 최근 해조류에 함유된 탄 수화물이 혈관콜레스테롤 침착 방지 및 장관 운동을 원활 히 하고, 중금속 배출을 촉진시키며 고지혈증의 개선 등, 식용 해조류로부터 생리활성 물질들이 확인되면서 기능성 식품으로서의 개발에 관심이 모아지고 있다^14,15).

미역(Undaria pinnatifida)은 대표적인 갈조류로서 다당 류인 alginate, fucoidan 이 풍부하고 미역의 부위에 따라 유리아미노산인 alanine, glycine, glutamate 및 asparagine 등이 함유되어있다¹⁶⁾. 그 중, 산성수용성 다당류인 fucoidan 은 혈액응고작용, 항종양 및 항암활성, 항산화 효과가 연 구된 바 있다. 또한 미역에 다량 함유된 alginate는 효소에 의해 분해되면 alginate oligomer가 된다. 이것은 면역세포 에서의 cytokine 분비 증가와 아연의 생체 이용률을 개선 시킴으로 체내 면역시스템 활성에도 직·간접적으로 기여 하는 등 많은 연구로 기능성이 입증되고 있다^17-19). 그러나 미역을 프로바이오틱스 배양단계에서부터 첨가하여 프로 바이오틱스의 면역증강 효능을 높이는 연구는 보고 된 바 없다.

따라서 본 연구에서는 신바이오틱스 제제로서의 체내 유 용성을 규명 하고자, 미역을 프로바이오틱스 배양 단계부 터 첨가하여 실험실 수준(1 L 플라스크 배양)과 생산 수준 (50 L 발효조 배양)에서의 연구를 진행하였다. 기존 프로 바이오틱스의 취약점인 대량배양 및 체내 안정성 개선과 면역증강 효과를 추가로 확인하고, 이를 통해 향후 기능 성 식품 및 의약품으로 산업적 이용의 가능성을 제시할 수 있는 기초자료를 얻고자 하였다.

Materials and Methods

배지

기본배지는 공개되어 있는 기존 유산균 생산업체의 자료 를 기본으로 고가의 성분을 제외한 2% glucose, 0.5% yeast extract, 0.2% (NH₄)₂SO₄, 0.1% KH₂PO₄, 0.1% K₂HPO₄, 0.05% Tween 80 및 정제수 잔량을 포함하는 기본 유산균 배양배지 조성물을 준비하고 미역분말을 1% 첨가하여 미 역첨가 배양배지를 제조 후, 121°C에서 15분간 멸균 후 사용하였다.

실험에 사용된 미역은 건조된 완도산 미역(sea mustard, Undaria pinnatifida)을 수분량이 10% 미만이 되도록 2차 건조 후, 분쇄하고 11,000 가오스 자석 및 흔들채에 통과 된 80 mesh 미역분말을 밀봉 판매하는 (주)가루나라에서 구입하여 –20°C에서 냉동 보관 후 사용 하였다.

균주

식물성 유산균인 L. plantarum 균주는 한국 미생물보존 센터(KCCM 11322, ATCC 8014)으로 부터 분양 받았고, MRS (de man rogosa and sharpe) 배지에서 3회 이상 계대 배양을 거쳐 glycerol stock법으로 –70°C에 균주를 보관하 였다.

면역증강 실험은 제조 배지에 배양 후 생균과 사균으로 분리하여 생균은 10⁴ CFU부터 10¹ CFU까지 희석하여 사 용하였으며 사균은 100°C에서 15분간 끓이고, 식힌 뒤 세 포에 처리 하였다.

배양

실험실 수준으로 제조배지를 1 L로 제조하였다. 또한, 산 업적 유용성을 평가하기 위해 50 L 발효조(X cellex)를 이 용하여 제조배지를 제조하였다(생산 수준). MRS 액체배 지에 접종하여 전배양 시킨 유산균을 10%로 본 배양배지 에 접종하였으며, 배양 온도 37°C, 교반속도 180 rpm으로 배양하며 시간별로 생균수를 확인하였다.

프로바이오틱스 pH 및 생장활성도 평가

배양 후 pH 변화는 pH 미터(mettler-toledo)를 활용하여 측정하였다. 생균수는 균배양액을 생리식염수로 10배씩 연 속적으로 희석시키고, 그 희석액 1 mL에 plate count agar 9 mL을 혼합하는 pour 법으로 확인하였다. 37°C에서 48시 간동안 배양하고 생성된 colony 수를 계수하여 생성 콜로 니 개수(colony forming unit per gram, CFU/mL)로 생균 수를 측정하였다.

인공위액 내성

인공위액에 대한 내성은 1 mg/mL 펩신용액에 염산을 이 용하여 pH를 2.5로 조정하여 인공위액을 조제하였다²⁰⁾. 여 기에 유산균을 10³ CFU/mL 접종하고 37°C에서 배양하며 1, 3, 6시간 마다 생균수를 측정하였다.

담즙산 내성

인공 담즙산에 대한 내성평가는 0.02 M 콜릭산, 0.02 M 디옥시콜산, 0.05 mg/mL 리파아제, 0.02 mg/mL 판크레아 틱용액에 1 N 염산 및 수산화 나트륨을 이용하여 pH 8.0 로 조정하여 인공 담즙산을 준비하였다²⁰⁾. 인공 답즘산에 준비한 유산균 현탁액을 접종하여 37°C에서 배양하며 1, 3, 6시간 마다 생균수를 측정하였다.

열 안정성

열 안정성은 MRS broth에서 배양한 유산균을 55°C에 2 시간 방치 후 1, 3, 6시간 마다 생균수를 측정하였다.

면역 세포독성 및 활성 측정

마우스의 대식세포인 RAW 264.7 세포를 96 well plate 에 1 × 105 cells/well의 농도로 분주되도록 1 × 10⁶ cells/mL 의 세포를 100 uL씩 넣고 37°C, 5% CO₂ incubator에서 24 시간동안 배양한 후, 배지를 버리고 배양세포 표면을 phosphate buffered saline (PBS) 용액으로 씻어주었다. 유 산균 현탁액은 생균 및 사균으로 각각 10, 10², 10³, 10⁴ CFU/well의 농도로 각각 처리하고 24시간 동안 배양하였다.

배양이 끝난 뒤, 면역증강 지표인 Nitric oxide의 측정은 상층액과 같은 양의 Griess reagent (5% 인산에 용해된 0.1% N-1-naphthylethylenediamine과 1% sulfanilamide을 1:1로 혼합)을 처리해 실온에서 10분 방치 후 microplate reader (TECAN, CA, USA)를 이용하여 550 nm에서 흡광 도를 측정하였다.

TNF-α 측정 역시, 배양이 끝난 상층액으로 TNF-α ELISA Kit (R&D)을 활용하여 정량하고 490 nm에서 흡광도를 측 정하였다.

통계분석

시험에 얻어진 결과는 평균 ±표준편차로 표기하였으며, Graphpad Prism v5.0 프로그램을 활용하여 student t-test를 수행하여 유의성을 검증하였다. 실험군이 3개 이상인 경 우 일원분산분석(one-way ANOVA)를 수행한 후 Tukey's multiple comparison test로 검정하였다. 통계적인 유의성은 P 값이 0.05 이하인 경우를 기준으로 판정하였다.

Results and Discussion

프로바이오틱스 증식률

L. plantarum는 김치에서 분리된 식물성 프로바이오틱스 로 면역강화, 정장작용, 항산화, 항암 등 다양한 생리활성 을 나타내며, L. plantarum 균주가 L. casei 균주 및 Leuconostoc 속보다 위산 및 담즙산 내성이 우수하다고 보 고된 바 있고 이를 활용한 식품 및 의약학 분야가 점점 확대되고 있다^21,22). 본 연구에서는 식물성 프로바이오틱스 인 L. plantarum의 산업적 활용을 위한 고농도 대량 배양 및 면역 기능성, 안정성을 높일 수 있는 방법으로 알칼리 성 대표 해조류인 미역을 배양단계에서부터 첨가하여 연 구를 진행하였다.

유산균주는 유기산을 생성하며 자신이 생산한 유기산에 의해 균체가 사멸되는 현상이 발생하므로 배양 중에 적절 하게 pH 조절하는 조건의 설정이 필요하다. 그러나 pH 조 절제의 사용은 배양액 내 이온강도를 지속적으로 증가시 켜 균의 활력과 증식을 감소시킬 뿐만 아니라 많은 양의 알칼리 용액의 첨가로 인하여 배양액이 희석되므로 균의 생화학적 환경변화를 가져올 수 있으며 유산균의 효율적 인 고농도 균체를 얻는데 한계가 있다. 이를 개선하기 위 해 화학물질 대신 calcium carbonate-alginate bead를 대체 제로 이용한 연구가 발표된 바 있다²³⁾.

본 연구에서는 실험실 수준의 기본배지와 미역첨가배지 를 비교 하였을 때 별도의 pH 조절 없이 균 배양 2시간 후 pH 5.0, 4시간 후 pH 4.0 이하로 떨어지는 것을 알 수 있었다(Fig. 1A). 배양 종료시점인 24시간 배양 후 pH는 3.5이하였으며 생균수를 측정해 보았을 때 기본배지는 8.5 ± 2.1 (10⁸CFU/mL), 미역첨가배지는 9.5 ± 3.5 (10⁸ CFU/mL)으로 pH 저하로 인해 균의 성장이 감소되는 것 을 알 수 있었다(Fig. 1B).

본 실험 조건에서 pH 조절 없이 대수기에 이르는 시간 은 기본배지는 12시간째 55 ± 7.0 (10⁸CFU/mL) 미역첨가 배지는 18시간째 271 ± 26.8 (10⁸CFU/mL)으로 차이를 나 타냈다(Fig. 1B).

실험에 사용한 미역은 회분식 산도 측정을 통해 김, 다 시마 보다 높은 알칼리성을 나타내었으며 미역을 첨가하 였을 때 화학적 중화제의 첨가 없이 실험실 수준에서의 미역첨가배지의 대수기 균수는 기본배지에 비해 4.9배 높 은 것을 알 수 있었다. 이러한 결과는 수산화나트륨으로 pH 6.8로 유지하며 24시간 배양한 Moon et al.²⁴⁾의 생균 수 10.74 ± 0.73 (10⁹CFU/mL)와 비교하여도 2배의 증가율 을 나타내는 것을 알 수 있다. 생산 수준 배양에서는 18 시간째에 1022의 고농도 프로바이오틱스 생산을 확인하였 다(Table 1). 이러한 결과는 미역첨가배지를 사용하였을 때 별도의 pH 조절제를 첨가하지 않아도 단시간 내에 L. plantarum의 고농도 배양이 가능한 것을 알 수 있었다.

열 안정성

프로바이오틱스가 제품으로 이용될 경우에는 미생물 생 육 최적조건과는 달리 고온 등의 온도 변화에 노출될 수 있다. 또한 제제화 방법인 spray dring과정 동안 고온의 환 경에 노출되면 생균력이 급격히 감소 될 수 있으므로 이 에 대응하여 세포의 열에 대한 내성이 높은 균주를 선별 및 배양 하는 것이 중요하다.

미역첨가배지의 열안정성은 55°C에서 6시간 배양하면서 각 시간별로 생존하는 수를 조사하였다. 모두 1시간째는 약 기본배지는 70%, 3시간째에는 55% 생존하여 비슷한 감소 율을 보였다. 6시간째 기본배지는 18%, 실험실 수준으로 배양한 미역첨가배지는 12% 생존율을 보이는 반면 생산 수준으로 배양한 미역첨가배지의 유산균 생존율은 30%로 열 안정성 면에서 유의적인 차이를 나타내었다(Fig. 2).

위액 및 담즙 내성

유산균은 섭취 후 프로바이오틱스로 정장작용 및 체내 에서 여러 생리적 기능을 발휘하기 위해서는 소화관 내의 조건에서 생존하여야 한다. 섭취한 균이 최종적으로 장에 도달하여, 정장작용 및 면역기능을 발휘하기 위해서는 위 액과 담즙이 존재하는 환경에서 생존이 요구된다.²⁵⁾. 순수 한 위액은 pH 1.0-2.0 정도로 유지되어 대부분의 미생물 은 위액 내에서 사멸되나 섭취한 음식물의 완충 작용에 의해서 다소 pH가 높아져 미생물의 사멸을 감소시킬 수 있다²⁶⁾. 그러나 유산균이 생리적 기능을 발휘하려면 위산 에 대해 생존이 가능하여야 한다.

각 균주의 인공 위액에 대한 내성을 측정하기 위해 pH 2.5 및 소화효소인, 펩신을 함유한 인공위액에 배양한 균 주를 접종하여 시간별로 생균수를 측정하였다. 시험 결과, 실험실 수준에서 1시간 배양 후 기본배지 생균수는 42%, 미역첨가배지는 46%, 생산 수준의 미역첨가배지 배양은 56%의 유산균 생존율을 나타내었다. 생산 수준에서 3시간 배양 후 미역 첨가 배지의 유산균의 생존율은 27%로 기 본배지 배양보다 위산에 대한 안정성 면에서 유의적인 차 이를 나타내었다(Fig. 3). 인공 담즙에 대한 내성을 측정 한 결과는 Fig. 4에 나타내었으며 초기반응인 1시간 후 기 본배지(66%)에 비해 미역첨가배지에 배양한 유산균의 생 존율이 실험실 수준 배양은 70%, 생산 수준 배양은 76% 를 나타내었다. 3시간과 6시간 후에도 생산 수준의 미역 첨가배지로 배양한 유산균의 생존율은 각각 37%, 21%로 기본배지와 비교하여 유의적인 차이를 나타내었다.

미역을 첨가한 배지에서 배양한 프로바이오틱스가 인공 위액에서 생존이 가능하고 인공담즙에서도 내성을 가지는 것으로 보아 섭취 후 장까지 도달하여 정장작용 및 장관 면역활성을 통한 인체 면역증가가 유도 될것으로 예상된 다. 이는 유용한 생균제가 장내에서 기능을 하기 위해서 는 장내 위장의 낮은 pH와 소장의 담즙에 대한 강한 내 성을 가져야 한다는 점을 고려할 때 미역 첨가배지를 이 용한 배양법이 기능성 프로바이오틱스 배양에 우수하다고 사료된다.

면역증강

기존의 유산균 기능성은 발효유의 품질평가에서 생균수 를 기준으로 하였기 때문에 생균 중심의 연구를 수행하였 다. 그러나 면역학이 발전하면서 생균 중심의 연구에서 사 균체의 기능으로 관심이 바뀌고 있다²⁷⁾. 이러한 점을 고려 하여 미역첨가배지에 배양한 프로바이오틱스 면역증강을 생균과 사균(Heat killed)의 상태로 대식세포에 대한 활성 을 검토하였다.

면역기능성 검증에 사용한 대식세포는 체내로 이물질(감 염성 미생물 등)이 침입하였을 때 이들을 초기에 비 특이 적으로 제거시키는 탐식세포로써, 세포 매개성 면역에 중 요한 역할을 하는 면역세포이며 종양억제 작용 등 다양한 기능을 수행한다. 또한 항원을 탐식 및 분해하여 그 일부 를 자신의 세포 표면에 부착 및 제시함으로써 림프구에 대한 면역반응을 유도하며 후천성 면역계가 작동할 수 있 도록 effector cell로서의 작용한다.

이러한 대식세포에 배양한 유산균을 첨가하여 세포 독 성 및 면역증강을 측정한 결과, 생균의 조건에서는 10⁴ CFU를 처리한 기본배지에서 45%의 세포 독성을 나타내 었지만, 미역첨가배지에서의 유산균 처리 그룹에서는 세 포독성이 나타나지 않음을 확인 하였다. 또한 사균의 상 태에서는 모든 그룹에서 세포독성을 나타내지 않음을 확 인하였다(Fig. 5A).

RAW 264.7 세포에서 미역첨가배지에서 아질산 이온 (NO^2–)의 농도는 생균으로 처리하였을 때 실험실 수준 배 양에서 기본배지는 10⁴ CFU를 처리한 그룹에서는 6.40 ± 0.14 μM, 미역첨가배지에서는 11.1 ± 0.03 μM로 1.7배 증 가하였고 유의적인 차이를 나타내었다(p < 0.05). 사균에 서는 기본배양과 실험실 수준 배양의 미역첨가배지 배양 에 차이는 없었다. 하지만 생균과 사균 모두 생산 수준 의 미역첨가배지 배양에서는 10⁴ CFU로 처리하였을 때 아질산 이온의 농도가 유의적으로 증가된 것을 알 수 있 었다(Fig. 5B).

미역첨가배지에서 종양괴사인자인자 TNF-α는 실험실 수 준 배양에서 기본배지는 10⁴ CFU를 처리한 그룹에서는 0.45 ± 0.14 ng/mL, 미역첨가배지에서는 1.11 ± 0.35 ng/mL 로 2.4배 증가하였고 유의적인 차이를 나타내었다(p < 0.05).

사균에서는 기본배양과 실험실 수준 배양의 미역첨가배 지 배양에 차이는 없었다. 하지만 생균과 사균 모두 생산 수준의 미역첨가배지 배양에서는 10⁴ CFU로 처리하였을 때는 각각 2.16 ± 0.12 ng/mL, 1.18 ± 0.26 ng/mL으로 TNF- α의 농도가 유의적으로 증가된 것을 알 수 있었다(p < 0.05, Fig. 5C).

실험실 수준 배양과 비교해 발효조를 이용한 생산 수준 배양은 유산균 증식을 위한 공기량을 일정하게 공급함으 로서 미역첨가배지 배양에 따른 유산균의 배양능, 안정성 및 면역원성을 높인 것으로 사료된다. 뿐만 아니라 미역 첨가배지를 활용해 생산 수준에서 L. plantarum을 배양할 경우 일반배지에 배양한 L. plantarum과 비교하여 생균과 사균 모두 면역원성을 더 효과적으로 개선할 수 있음을 보여준다.

국문요약

본 연구에서는 식물성 프로바이오틱스에 해조류인 미역 을 첨가하여 프로바이오틱스의 체내 안정성 및 면역원성 을 향상 시킬 수 있는 고농도 배양법을 개발하고자 하였 다. 미역 첨가 배지를 생산 수준으로 유산균을 배양하였 을 때 유산균수는 18시간째 10²², 24시간째 10⁹으로 고농 도 배양이 가능하였다. 미역첨가배지로 배양된 유산균의 열 안정성, 위산 및 담즙 안정성의 효과도 기본배지와 비 교 하여 유의적인 증가를 확인할 수 있었다. 미역첨가배 지로 배양된 프로바이오틱스는 생균 및 사균 모두 면역증 강효과를 나타내는 것을 알 수 있었다. 배양만으로 기능 성이 향상된 프리바이오틱스를 개발함에 따라, 다양한 프 로바이오틱스의 기능성 향상의 기반 기술로서 활용이 가 능할 것으로 사료 된다.