현대 사회는 기후 변화에 따른 생태계 변화, 대기오염, 황사, 실내주거환경, 서구화된 식습관 등에 의하여 천식, 알레르기 비염, 아토피, 만성 폐쇄성폐질환 등 알레르기 질환이 증가 추세를 보이고 있다¹⁾. 특히, 알레르기 질환의 대상이 어린아이까지 확대되면서 사회적 이슈가 되고 있 으며 다양한 알레르기 질환 치료제들이 개발되고 있는 상 황이다.

외부 알레르겐(allergen)이 우리 몸속으로 침입하면, B 림프구는 침입한 알레르겐을 인식하고, 형질세포로 분화 한다. 이때 분화된 형질세포는 항원을 특이적으로 인식하 는 Immunoglobulin E (IgE)를 분비하게 된다. 이러한 조 건에 의하여 항원 특이 IgE 항체가 비정상적으로 증가하 게 되며 증가한 IgE는 비만세포 표면의 IgE 고 친화성 수 용체(FcεRI, high-affinity receptor for IgE)에 결합하며 외 부로부터 알레르겐(allergen)이 다시 들어오면 항원-항체 반 응이 진행되면서 비만세포를 활성화시킨다²⁾.

비만세포는 세포 내에 과립들을 가지고 있는데, 비만세 포가 활성화되면 세포 내의 과립에 저장되어 있던 히스타 민, 헤파린 및 단백분해효소 등이 세포 밖으로 분비되고 류코트리엔, 프로스타글란딘 등의 화학매개체들을 만들어 낸다. 이러한 화학매개체들은 짧은 시간 내에 혈관을 확 장시켜 투과성을 증가시키고 우리 몸의 평활근 수축 및 분비선의 기능을 증가시켜 알레르기 증상을 유도한다³⁾.

비만세포 표면에 존재하는 FcεRI는 α, β, γ-subunit으로 구성되어있다⁴⁾. 이 중 β, γ-subunit는 세포 내 신호전달에 관여한다. 알레르겐이 IgE와 교차결합하면 β-subunit에 결 합되어있던 Src-kinase에 의해 수용체가 인산화 되면서 세 포 내 신호전달이 시작된다. 또한 β, γ-subunit은 수용체에 결합되어있던 Lyn kinase에 의해 ITAM (Immunoreceptor tyrosine-based activation mitif)이 인산화 된다⁵⁾. 인산화 된 ITAM은 세포 활성화에 중요한 역할을 하는 Syk kinase의 결합부위를 제공하여 Syk kinase를 활성화 시키고 그 후 아래의 하위 신호전달물질의 활성화를 유도한다⁶⁾.

항원에 의한 비만세포 활성화 과정 초기에 가장 중요한 신호전달단백질인 Syk가 활성화되면서 하위 신호전달 Linker for activation of T cells (LAT), phospholipase(PL)- Cγ, PKC (protein kinase C) 등 다양한 신호전달 물질이 활성화되고, 결과적으로 비만세포가 활성화되면서 히스타 민, 프로스타글라딘, 루코트리엔 및 과민증인자 등을 분비 하여 면역체계를 활성화시키고, 염증 및 알레르기를 발생 시킨다⁷⁾. 이와 같이 세포내 신호전달 기전에 대한 연구는 알레르기 질환 연구에서 중요한 부분을 차지한다. 본 논 문에서도 FcεRI 매개한 신호전달에 중점을 두어 실험을 진행하였다.

낙지다리(Penthorum chinense Pursh)는 돌나물과(Crassulaceae) 의 다년생 초본으로 근경이나 종자로 번식한다. 전 국적으로 분포하며 강가나 풀밭의 습기가 많은 곳에 분포 한다. 낙지다리 추출물은 간과 신경세포의 보호 효과가 있 는 것으로 보고되어 있다⁸⁾. 하지만 알레르기 질환에 대한 낙지다리의 효능에 대한 보고는 존재하지 않는다. 본 연 구에서는 낙지다리 추출물의 비만세포 억제 효과 및 알레 르기 유발 동물모델에서 알레르기 억제 효과 등을 규명하 기 위해 수행하였다.

Materials and Methods

재료

Dinitrophenol(DNP)-specific IgE와 항원(DNP-bovine serum albumin, DNP-BSA)는 Sigma-Aldrich Co.(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 또한 PP2는 Calbiochem (La Jolla, CA, USA)에서 구입하였다. RPMI-1640 및 Minimal Essential Medium (MEM), 배양액에 첨가되는 Glutamine과 그 외 세포배양 시약은 GIBCO Technologies Inc. (Rockville, MD, USA)에서 구입하였다. Western blot에 사용되는 Phospho-Syk 및 Phospho-LAT 항체는 Cell signalling Technology (Danvers, MA, USA)에서 구입하였으며 그 외 에 actin을 검출하기 위한 항체는 Millipore (Billerica, MA, USA)에서 구입하였다. 기타 모든 시약은 시중 제품 중 특 급 시약을 구입하여 사용하였다.

실험동물

실험에 사용한 동물은, (주)오리엔탈바이오(성남)에서 생 후 5 주령 수컷 Balb/c 마우스를 구입하여 사용하였다. 물 과 사료는 자유롭게 먹도록 하였으며, 사육환경은 온도 22 ± 1°C, 습도 55 ± 10%로 유지하였고, 낮과 밤의 주기는 각 각 12 시간으로 하였다. 모든 실험동물은 1 주일동안 적응 시킨 후 실험에 사용하였다. 동물실험은 덕성여자대학교 동 물실험윤리 회의 승인을 받아, 동 규정에 따라 실험을 진 행하였다.

낙지다리의 메탄올 추출물(PCE) 제조

낙지다리 추출물(분양번호, 007-019)은 한국식물추출물 은행으로부터 분양받아 실험을 진행하였다. 낙지다리 추 출과정은 건조된 낙지다리 전초 100 g을 50°C 메탄올 1000 ml에서 초음파 추출기를 이용하여 하였으며 스피드 백을 이용하여 40°C에서 24시간 건조과정을 거쳤다. 이러 한 과정으로 추출한 최종 회수율은 약 15% 였다. 비만세 포 억제 실험에 사용하기 위해서 DMSO (dimethyl sulfoxide) 에 용해시켜 100 mg/ml 농도로 제조 한 후, 최종 처리 농 도로 희석하여 실험에 적용하였다.

비만세포(BMMC, RBL-2H3)의 분리 및 배양

RBL-2H3 (Rat Basophil Leukemia) cell은 ATCC (American Type Culture Collection)에서 분양받아 15% FBS가 포 함된 MEM (penicillin /streptomycin 및 L-glutamine 포함) 을 배양액으로 하여 5% CO₂ incubator에서, 2-3일 간격으 로 계대 배양 하였다.

생쥐의 골수에서 유래한 비만세포(BMMCs, Bone marrowderived mast cells)는 5주령의 수컷 Balb/c 마우스의 골수 로부터 채취하였다. 마우스로부터 분리한 골수의 세포는 RPMI배지(RPMI 1640, 10% FBS, 0.1 mM non-essesntial amino acid 및 2 mM L-glutamine)에 IL-3(10 ng/ml)이 포 함된 배양액을 사용하여 4주 이상 배양 후 BMMC로의 분 화가 98%이상 되었음을 FACS분석을 통해 확인한 후 실 험에 사용하였다.

비만세포의 탈과립(β-hexosaminidase) 측정

BMMCs(3.3 × 10⁵/well) 혹은 RBL-2H3 cells(1.8 × 10⁵/ well) 두 종류의 비만세포를 24-flask에 분주하고 20 ng/ml DNP-특이 IgE를 포함한 배지에서 12시간이상 감작하여 비 만세포 FcεRI에 IgE가 결합하도록 하였다. β-hexosaminidase 분비 측정은 Tyrode (135 mM NaCl, 5 mM KCl, 20 mM HEPES, 5.6 mM glucose, 1.8 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 0.5% fatty acid-free fraction V from bovine serum, pH 7.4) 완충용액과 PIPES (25 mM PIPES, 159 mM NaCl, 5 mM KCl, 0.4 mM MgCl₂, 1 mM CaCl₂. 5.6 mM glucose, 0.5% fatty acid-free fraction V from bovine serum, pH 7.4) 완 충용액을 이용하여 실험을 진행하였다. 우선 37°C 완충용 액으로 각각의 세포를 2번 세척 후 well당 각 농도별로 완 충용액에 희석된 추출물을 첨가하고 30분 전처리를 하였 다. 그 후 20 ng/ml의 항원을 각 well에 첨가하여 10분 동 안 세포자극을 진행하였다. 10분 incubation 후 약 7분간 얼음 위에서 자극을 정지시켰다. 탈과립에 의해 세포 밖으 로 분비된 β-hexosaminidase을 측정하기 위해 위의 과정을 거친 각 well의 상층액과 Triton X-100으로 세포를 파쇄하 여 얻은 파쇄액을 각각의 96 well plate에 30 ul씩 분주하 고 1 mM p-nitrophenyl-N-acetyl-β-d-gluco saminide를 넣고 1시간 동안 반응시킨 후 250 ul의 0.1 M carbonate buffer 를 넣어 반응을 종료한 뒤 405 nm에서 흡광도 측정하여 정량하였다.

Cell viability

96well plate에 well 당 2.2 × 10⁴개의 세포를 분주하고 5% CO₂ incubator에서 12시간 배양하였다. 그 후 PCE를 10 ug/ml, 30 ug/ml, 100 ug/ml 농도별로 처리한 후 CO₂ incubator에서 1시간동안 반응시켰다. 1시간 후 각 well에 CCK-8 (cell counting kit-8)을 첨가한 후 1시간 동안incubation을 시킨 다음 ELISA reader를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

Immunoblotting 분석

IgE로 감작된 BMMCs, RBL-2H3 cells에 PIPES (or Tyrod buffer)로 희석한 PCE를 각각 농도별로 첨가한 다 음, 20 ng/ml의 항원을 넣어 10분 동안 자극하고 얼음위에 서 반응을 정지시켰다. 항원에 의해 자극된 세포는 약 4°C PBS 완충용액으로 2번 세척한 후 세포파쇄용액 (20 mM HEPES, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1% nonidet P-40, 60 mM octyl β-glucoside, 10% glycerol, 10 mM NaF, 1 mM phenylmethyl- sulfonyl fluoride (PMSF), 1 mM Na3VO4, 2.5 mM nitrophenyl-phosphate, 0.7 mg/ml pepstatin, and a proteaseinhibior cocktail tablet)으로 10분간 세포를 파쇄 후 15,000rpm, 10분간 4°C에서 원심분리기한 다음 상등액을 얻었다. 이 상등액을 이용하여 단백질 정량 후 100°C에서 3x Laenmmli buffer로 약 5분간 끓였다. 정량된 단백질은 SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis) 로 분리 후 nitrocellulose membrane으로 옮겨 5% BSA를 포함한 TBS-T (10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.05% Tween 20) 완충액으로 1시간 동안 blocking을 시켰다. 이후 분석하고자 하는 단백질에 대한 1차 항체를 1000배로 희석하여 4°C에서 overnight로 반응 시킨 후 TBS-T로 세척한 뒤 2000배로 희석한 HRP-conjugation된 2차 항체로 1시간 상온에서 반응시켰다. 이후 10분씩 5번 TBS-T 완충액으로 세척하고 chemiluminescence analyzer로 단백질 밴드를 확인하였다.

국소적 수동 피부 알레르기 마우스 동물 모델

DNP (dinitrophenol)-specific IgE에 의한 국소 알레르기 피부 반응(passive cutaneous anaphylaxis, PCA)을 유도하 기 위해 마우스(BALB/c, 5주령 수컷) 의 오른쪽 귀에 DNPspecific IgE를 피내로 0.5 μg를 주사하였다. 다음 날 5% 아라비아검 용액에 녹인 낙지다리추출물을 40 mg/kg, 200 mg/kg, 1000 mg/kg 경구 투여 하였다. 1 시간 후 항원(DNPBSA, 1 mg/ml)을 에반스 블루 용액을 이용하여 5 mg/ml 농도로 제조하여 250 μl를 꼬리로 정맥 투여하였다. 1 시 간 후 마우스를 안락사 시키고 귀를 적출하여 700 μl의 포 름아마이드로 63°C에서 12 시간 동안 에반스블루를 추출 후 상등액을 620 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 에 반스 블루의 정량은 표준 정량곡선을 이용하여 측정하였다.

통계처리

모든 실험결과는 mean ± S.E.로 나타내었으며, 각 군 간 의 비교는 one-way analysis of variance (ANOVA)에 이은 Student’s t-test 분석을 실시하였다. 대조군과 비교하여 p 값이 0.05 미만일 경우에 통계적으로 유의성이 있다고 판 정하였다. 모든 실험은 3회 반복으로 실시하였다.

Results

비만세포(RBL-2H3 세포)의 탈과립(β-hexosaminidase) 억 제효과

IgE 감작된 비만세포는 항원으로부터 자극을 받으면 비 만세포 과립 안에 있던 histamine, β-hexosaminidase, 다양 한 proteases 등을 세포 밖으로 방출하여 알레르기 반응을 유도한다. 본 실험에서는 탈과립의 지표로 사용되는 β- hexosaminidase를 측정하여 낙지다리 추출물의 억제효과를 확인하였다⁹⁾. 항원자극에 의한 비만세포에서의 β-hexosaminidase 분비가 농도 의존적으로 억제되었으며, 처리농 도 100 μg/ml에서 비만세포의 탈과립 현상이 약 80% 정 도가 억제되는 우수한 효능이 관찰되었다(Fig. 1). 이러한 억제효과는 대조약물로 사용된 PP2의 억제효과와 유사하 게 나타났다.

PCE의 비만세포 탈과립 억제 효과의 가역성 실험

RBL-2H3 세포에 한 그룹은 PCE를 100 μg/ml으로 30분 동안 전처리를 진행 하였고 다른 한 그룹은 PCE를 동일 한 농도로 30분 전 처리 한 후 PIPES 완충용액으로 5회 세척하여 탈과립의 현상이 회복되는 것을 관찰하였다. PCE 100 μg/ml 농도로 전처리한 군에서 β-hexosaminidase 분비 는 대조군과 비교하여 70% 이상 억제 되었으나 PIPES 완 충용액으로 5회 세척해 준 군은 대조군의 약 90%까지 회 복되었다(Fig. 2). 이러한 결과로부터, PCE의 비만세포 탈 과립 억제효과는 가역성을 가짐을 알 수 있었다.

PCE의 비만세포에서 염증성 사이토카인 분비 억제 효과

본 연구에서는 PCE 전처리에 의한 비만세포에서의 사 이토카인 생산 억제 효과를 RT-PCR 기법으로 측정하였다. PCE는 농도 의존적으로 TNF-α 와 IL-4의 mRNA 발현을 현저히 억제하였다(Fig. 3A). IL-4의 mRNA 발현은 PCE 30 μg/ml 농도에서부터 대조군과 비교하여 유의적으로 억 제되었으며(p < 0.05), TNF-α의 mRNA 발현은 PCE 100 μg/ml 농도에서 대조군과 비교하여 유의적으로 억제되었 다(p < 0.05), PCE 100 μg/ml에서는 대조약물로 사용된 PP2 와 유사한 정도의 억제 효과가 관찰되었다(Fig. 3B).

PCE의 세포내 칼슘 농도 증가에 따른 탈과립의 억제 효과

본 연구에서 PCE의 비만세포 탈과립 억제효과의 기전 을 연구하기 위해 우선 이 억제효과가 칼슘이온 증가의 상위 신호전달물질인지 하위 신호경로를 억제하는 것인지 를 알아보기 위해 본 실험을 진행하였다. 비만세포를 이 오노마이신 과 탭시가긴을 처리 시 비만세포에서 탈과립 이 증가하는 것을 관찰할 수 있었다. 하지만 이러한 물질 을 처리하기 전 PCE을 전처리하였을 때 PP2 와는 달리 PCE의 전처리에 의해서 탈과립의 억제 효과는 보이지 않 았다(Fig. 4). 이러한 결과는 PCE에 의한 비만세포에서의 탈과립 억제효과는 칼슘에 의한 신호전달경로 상위에서 일어나는 것으로 추정된다.

PCE의 비만세포에서의 Syk 및 LAT의 인산화 억제 효과

Fig. 5에서, PCE는 농도 의존적으로 Syk kinase의 인산 화를 억제하여 활성을 감소시키는 것을 확인 할 수 있었 다. 또한 Syk kinsae의 인산화 활성이 억제됨으로 LAT 인 산화 활성역시 감소하는 것을 확인하였다. 따라서 낙지다 리추출물은 Syk kinase의 인산화를 억제하므로서 항원에 의해 유도되는 비만세포의 탈과립을 억제할 수 있음을 알 수 있었다(Fig. 5). 이러한 결과는 RBL-2H3 cell 뿐만 아 니라 골수유래의 세포에서 분화시킨 비만세포(BMMC)에 서도 항원자극에의한 Syk/LAT 신호전달경로가 유사한 정 도로 억제된다는 것을 확인 할 수 있었다(Fig. 5).

PCE의 국소피부자극 알레르기 반응의 억제 효과

알레르기 동물모델에서 PCE의 알레르기 반응 억제효과 를 측정한 결과, 항원 자극에 의한 알레르기 반응은 잘 유 도 되었으며 PCE 처리에 의해 억제되었다(Fig. 6A). 이러한 억제 결과는 PCE 0-1000 mg/kg 농도 범위 내에서 농도 의존적으로 억제되었으며 최고농도인 1000 mg/kg 투여군 에서는 대조약물로 사용된 세트리진과 동일한 효과를 보 였다.

Discussion

질병관리본부가 실시한⌈천식 및 알레르기질환 조사⌋ 결과에 따르면, 최근 15년간(‘95년 ~ ‘10년) 알레르기 비염 은 어린이 1.3배, 청소년은 1.4배 증가했고, 알레르기결막 염은 어린이 1.9배, 청소년 1.9배 증가했다고 발표했다. 이 와 같이 알레르기 발병률은 어린아이로부터 성인까지 계 속해서 증가하는 추세이다¹⁰⁾. 현재 알레르기 치료제로는 알레르기를 일으키는 알레르겐(allergen)으로부터 보호하는 물리적 방법, 항히스타민제, 류코트리엔 수용체 길항제 등 이 있는데, 이 중 가장 널리 쓰이는 항히스타민제는 알레 르기 반응 시, 체내에 과다하게 분비되는 히스타민을 억 제함으로 알레르기 반응을 감소시키는 효과를 가지고 있 지만, 과량으로 사용할 경우 중추신경계 억제 및 녹내장, 전립선 비대 등 다양한 부작용을 동반하고 있다¹¹⁾. 이와 같이 현재 시판 되고 있는 약물 중 알레르기를 근본적으 로 치료할 수 있는 치료법은 미비한 상태이다. 따라서 알 레르기 질환을 치료할 근본적인 연구가 필요하다.

알레르기 질환에서 증상 발현에 중요한 역할을 하는 비 만세포(mast cell)의 활성의 조절은 알레르기 질환 치료제 개발에서 많은 연구의 대상이 되고 있다. 호염기구와 비 만세포에는 알레르기반응을 유도하는 화학매개체들이 포 함된 과립들이 세포질 내에 존재한다. 알레르겐이 외부로 부터 항원에 의해 자극되어지면 알레르기 반응을 일으키 는 물질을 생산, 분비한다¹²⁾. 이러한 화학매개체들은 과립 안에 이미 생성되어 저장되어있던 물질(preformed mediators) 과, 자극 후 새로 생성되는 물질(newly synthesized mediators) 로 구성된다. 비만세포 활성화시 분비되는 물질로는 히스타민과 세로토닌이 있으며, 그 외에도 IL-4, IL-13, TNF-α 등의 사이토카인을 분비하여 알레르기성 염증 및 림프구의 증식과 이동을 유도한다¹³⁾.

이러한 과정은 알레르겐 과 비만세포 표면의 고친화성 IgE 수용체(FcεRI)가 결합한 후 신호전달체계가 활성화 되 는 Fyn-Gab2-PI3K 경로와 Lyn-Syk-LAT 경로에 따라 진 행된다¹⁴⁾. 알레르겐 과 FcεRI 간의 집합이 이루어지면 수 용체의 β, γ-subunit의 ITAM이 Src-kinase에 의해 인산화 되고 Syk kinase와 인산화 된 ITAM이 결합하여 Syk의 구 조가 변형되면서 신호가 활성화된다. 그 후 하위 신호전 달분자 및 어댑터 단백질이 순차적으로 활성되어 비만세 포에서 알레르기 유도물질을 분비하고 알레르기 반응을 유도하게 된다¹⁵⁾. PCE은 세포독성이 없는 0-100 μg/ml에 서 비만세포 초기 활성신호전달경로인 Syk/LAT의 신호전 달경로 활성을 농도 의존적으로 억제함을 확인하였다(Fig. 5). 이러한 신호전달을 바탕으로 활성화된 비만세포는 세 포질 내 칼슘 농도가 증가되는데 이러한 증가는 비만세포 내의 과립의 탈 과립을 유도한다. PCE가 비만세포 탈 과 립 억제의 효과가 있음을 확인하였다(Fig. 1)

새로운 의약품이 개발될 때 그 물질의 체내 가역성은 매우 중요하다. 일반적으로 비가역적인 물질은 체내 투여 시 체내 단백질에 결합하여 그 단백질이 제거 될 때 까지 약효를 진속하게 되어 부작용 가능성을 증가 시킨다¹⁶⁾. 이 러한 비가역성에 의한 부작용 가능성을 관찰하기 위해 우 리는 낙지다리 추출물의 가역성 실험을 진행하였다. 실험 결과 낙지다리 추출물은 비만세포 활성 억제효과가 가역 적임을 관찰하였다(Fig. 2). 이러한 가역성은 낙지다리 추 추물의 부작용 가능성을 다소 낮추어 준 것으로 평가되었다.

최근에 비만세포억제를 통한 알레르기 반응 억제 효능 이 있는 식물 추출물에 대한 보고가 다양하게 진행 되어 지고 있다. 그 중에서 갈매나무 잎 추출물은 항원 자극에 의한 비만세포의 Fyn kinase 활성화 억제를 통해 알레르 기 반응을 억제하는 것으로 보고되었다¹⁷⁾. 꾸지뽕나무 추 출물은 항원에 의한 비만세포의 Lyn/Syk 경로의 활성화 억제를 통해 알레르기 반응억제 효능을 가지는 것으로 보 고되어 갈매나무 추출물의 억제 기전과는 다소 차이가 있 었다¹⁸⁾. 이러한 식물 추출물의 마우스에서의 알레르기 반 응 억제 ED₅₀는 대부분 200-500 mg/kg 이며 본 연구의 낙 지다리 추출물의 경우에도 유사한 ED₅₀를 보였다. 또한, 낙지다리 추출물은 비만세포의 신호전달과정 중 Syk kinase 의 활성화 억제를 통해 알레르기 반응을 억제하였다. 하지 만 이러한 억제가 어떤 상위 kinase의 활성 조절에 의한 것인지는 추후 보완 연구가 더 필요하다.

종합적으로 우리나라에서 자생하는 낙지다리 식물 추출 물은 항원 자극에 의한 비만세포의 탈과립, 사이토카인 분 비 및 동물모델에서 알레르기 반응을 세포내 Syk/LAT 신 호전달경로를 억제하여 나타남을 확인할수 있었다. 이러 한 억제 현상은 가역성을 가져 추후 사람에게의 적용 가 능성이 높아 환자에 적용하기 위해 독성 및 성분연구에 대한 추가 연구가 필요한 것으로 생각된다.