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ISSN : 1229-1153(Print)
ISSN : 2465-9223(Online)
Journal of Food Hygiene and Safety Vol.31 No.4 pp.278-285
DOI : https://doi.org/10.13103/JFHS.2016.31.4.278

Optimization of Extraction Conditions for Mixture of Camellia sinensis L. and Artemisia argyi by Response Surface Methodology

Young-Hyun Kim, Woo-Sik Kim1, Jae-Min Kim, Sun-il Choi, Tae-Dong Jung, Jin-Ha Lee, Jong-Dai Kim, Jae Kag Lim2, Ok-Hwan Lee*
Department of Food Science and Biotechnology, Kangwon National University, Chuncheon 24341, Korea
1G1-Bio Co. Ltd., Chuncheon 24461, Korea
2Department of Chemical Engineering and Biotechnology, Korea Polytechnic University, Gyeonggi 15073, Korea
Correspondence to: Ok-Hwan Lee, Department of Food Science and Biotechnology, Kangwon National University, Chuncheon 24341, Korea, +82-33-250-6454, +82-33-259-5565, loh99@kangwon.ac.kr
May 23, 2016 June 6, 2016 June 17, 2016

Abstract

This study used response surface methodology (RSM) in an effort to optimize the ultrasound-assisted extraction condition of Camellia sinensis L. and Artemisia argyi mixture in order to increase extraction yield in the extract. The effects of three independent variables, X1 (Mixture ratio, 60-80%), X2 (Ratio of water to raw material, 20~100 mL/g), and X3 (Extraction time, 25-145 min), were investigated at three levels using Box-Behnken design (BBD) to obtain the highest extraction efficiency. Y (Extraction yield) was chosen as dependent variable. Our result showed that the coefficient of determination (R2) of the model was 0.9747, with significant at the level of p < 0.002. Furthermore, the predicted values of each variable were similar to the actual values. The optimum extraction conditions were as follows: mixture ratio of 85.86%, ratio of water to raw material of 92.73 mL/g, and extraction time of 56.52 min. At these conditions, predicted extraction yield was 30.03%. The analysis of variance (ANOVA) indicated a high goodness of model fit and the success of the RSM method for optimizing extraction conditions of Camellia sinensis L. and Artemisia argyi mixture.


반응표면분석을 이용한 녹차와 애엽 혼합물의 추출조건 최적화

김 영현, 김 우식1, 김 재민, 최 선일, 정 태동, 이 진하, 김 종대, 임 재각2, 이 옥환*
강원대학교 식품생명공학과,
1(주)G1바이오,
2한국산업기술대학교 생명과학공학과

초록


    국민소득이 증가와 더불어 식생활 양식의 변화로 성인 에 이르기까지 비만의 유병률이 점점 높아지고 있으며, 이 로 인해 대사 증후군의 발병 및 사망률이 증가하고 있다1). 이러한 비만은 유전적, 영양적, 환경적 및 사회적 요인 등 다양한 원인들이 관여하는 것으로 알려져 있으며, 비만의 최대문제는 비만에 의해 발생되는 합병증이다2). 통계청 추 계에 따르면 대한민국은 고령화 속도의 증가로 인해 2020 년에는 고령 인구 비율이 15.6%에 달하고 2030년에는 24.3% 이상으로 초고령사회로 진입할 것으로 예상되어지 고 있으며, 이에 따라 건강관리 중요성과 만성질환의 예 방관리를 위한 기능성식품의 중요성에 대한 인식이 더욱 더 증가될 것으로 보인다3). 기능성식품 소재의 선택은 안 전성 문제로 식용근거가 있는 소재를 중심으로 인체에 대 한 안전성과 생리적 효능을 갖고 있는 천연유래 소재를 선호하는 경향이 높아지고 있다4,5). 질병은 치료되어야 한 다는 과거의 사고방식이 변하여 현대인들 사이에서는 치 료보다 예방이 우선시 되고 있으며, 편의 위주로 생활양 식이 변함에 따라 간편하게 이용할 수 있는 드링크류의 의약품이나 건강식품의 개발이 증가하고 있다. 특히 추출 물의 같은 경우 특정 성분의 농축, 첨가 등이 용이하여 단 일 소재보다는 여러 식물의 추출물을 혼합하여 기능성을 높이고자 하는 연구가 활발히 진행되고 있다6).

    차나무(Camellia sinensis L.)의 어린잎을 다린 녹차(green tea)는 epicatechin, epicatechin gallate, epigallocatechin-3- gallate (EGCG) 등의 폴리페놀류를 다량 함유하고 있다7,8). 녹차의 약리적 효과는 epicatechin 계열 성분들과 관련 있 으며, 200-300 mg 녹차가 들어있는 차 한잔에는 50-80% 의 EGCG가 존재하는 것으로 보고되었다. EGCG는 항산 화, 항암, 항노화, 항당뇨, 항비만 등의 다양한 생리활성을 가지고 있어 많은 연구가 이루어지고 있다9-13). 애엽은 국 화과에 속하는 다년생 초목인 황해쑥(Artemisia argyi Lev. et Vant.), 쑥(Artemisia princeps Pampanini), 산쑥(Artemisia montana Pampani)의 어린 잎 및 줄기를 말하며, 예로부터 지혈, 진통, 염증, 폐경기 질환에 효능이 있어 널리 사용 되어져 왔다14). 애엽의 주요 성분으로는 eupatilin과 jaceosidin이 있으며, 항암, 항당뇨, 항동맥경화 외에 NFkB 신호전달과정을 억제시켜 항염증 효과를 가지는 것으 로 보고되었다15-21). 이와 같이 녹차와 애엽은 약용식품 소 재로 생리활성 효능이 탁월하여 다양한 제품들이 생산되 고 있는 반면, 제조공정의 관한 연구는 아직 미흡한 실정 이다. 제품을 개발함에 있어서 우수한 생리활성 소재를 탐 색하는 것만큼, 소재의 특징을 고려하여 적은 비용으로 다 량의 유효성분을 추출 할 수 있는 공정의 개선도 중요하 다22). 추출방법에는 열수추출법23), 에탄올과 같은 유기용 매를 이용한 추출방법24), 마이크로파 추출법25), 초임계유 체 추출법26), 초음파추출법27) 등이 있으며, 열수추출법과 같이 물 또는 다른 용매를 이용하여 식물로부터 생리활성 성분을 추출하는 것이 보편적이다. 이와 같은 방법은 긴 추출 시간이 요구되기 때문에 용매와 온도의 조건을 다르 게 하여 추출시간을 단축시키거나 추출 효율을 높이기도 하지만 용매와 온도의 조건 만으로 얻을 수 있는 결과에 는 한계가 있으며, 오히려 높은 온도는 폴리페놀류 등과 같은 유효성분을 파괴시켜 생리활성 및 수율을 감소시키 기도 한다28).

    따라서 본 연구는 녹차, 애엽, 상엽, 의이인, 진피 중 실 험을 통해 지방세포(3T3-L1)의 분화억제 효능이 확인된 (data not shown) 녹차와 애엽 혼합물의 최적 추출조건을 확인하기 위해 반응표면분석(response surface methodology; RSM)으로 모니터링 하였다.

    Materials and Methods

    실험재료

    본 실험에 사용한 녹차(Camellia sinensis L.)와 애엽 (Artemisia argyi)은 (주)지원바이오으로부터 제공 받았으며, 각 건조물을 분쇄하여 40 mesh 표준망에 통과시켜 실험에 사용하였다. 항산화활성 및 총 페놀 함량 분석에 사용한 시약들은 sodium carbonate (Tedia Co., Ltd., Fairfield, OH, USA), aluminum nitrate (Wako Ltd., Osaka, Japan), sodium hydroxide (Samchun pure chemical Co., Ltd., Gyeonggi, Korea)를 사용하였으며 Folin-Ciocalteu's reagent, gallic acid, rutin, potassium acetate, (+)-catechin, potassium persulfate, ferric chloride, acetic acid, 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH), 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) (ABTS), 2,4,6-Tripyridyl-s-triazine(TPTZ) 등은 Sigma (Sigma- Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하 였다.

    추출방법

    녹차와 애엽 혼합물의 최적추출조건 설정을 위해 초음 파 기기(Mujigae Co., Ltd., Seoul Korea)를 사용하여 지속 적으로 초음파를 제공하였으며, 실험계획에 따라 녹차 및 애엽의 혼합비, 용매 용질의 비, 추출시간을 달리하여 증 류수로 추출하였다. 추출한 추출물은 여과지(Whatman, No. 3, Maidstone, Kent, UK)를 사용하여 여과한 후에 회전식 진공 농축기(Tokyo Rikakikai Co., Ltd., Tokyo, Japan)와 동결건조기(Ilshinbiobase Co., Ltd., Gyeonggi, Korea)를 사 용하여 농축 및 동결건조하여 추출수율(extraction yield, %)을 평가하였다.

    추출조건의 예비설정

    추출조건의 예비설정에 필요한 기초실험으로서 초음파 세기와 온도에 따른 영향을 확인하였으며, 추출조건 최적 화 실험의 기본조건으로 활용하였다. 초음파 세기에 따른 결과는 녹차와 애엽의 비를 1:1, 용매 용질의 비를 25배 로 하여 25°C에서 25분간 서로 다른 초음파 세기(0, 25, 50, 75, 100%)를 가하여 추출물의 항산화 활성을 평가함 으로서 추출정도를 비교하였으며, 온도에 따른 영향을 확 인하기 위해서 초음파를 처리하지 않고 각각 30, 50, 70°C 에서 1시간동안 3분 단위로 추출한 추출물의 DPPH 라디 칼 소거 활성을 지표로 결과를 비교하여 최적화 실험의 기본조건으로 활용하였다. 추출수율은 추출물을 동결건조 한 후, 추출원료 건물량에 대한 고형분의 수율로 나타내었다.

    총 페놀 함량 분석

    총 페놀 함량은 Folin-Ciocalteau의 방법을 변형하여 Folin- Ciocalteu's phenol reagent가 각 시료의 페놀성 화합물에 의해 환원된 결과 몰리브덴 청색으로 발색하는 것을 원리 로 분석하였다. 각 시료 1 mL에 2% sodium carbonate 용 액 1 mL와 10% Folin-Ciocalteu's reagent 1 mL를 혼합하 여 1시간 방치 후 microplate reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 750 nm에서 흡광도를 측정하였으 며, Gallic acid를 이용하여 작성한 표준곡선으로 부터 함 량을 구하였다29).

    2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH) 라디칼 소거 활성 측정

    전자공여능은 항산화 측정에 가장 많이 쓰이는 방법 중 에 하나이다. 이 실험에서 사용되는 DPPH는 항산화 활성 을 측정하기 위한 기질로 사용되며, phenol, flavonoid와 같은 페놀성 물질에 대한 항산화작용의 지표로 알려져 있 다. DPPH법은 자유 라디칼(free radical)로 특유의 색을 나 타나게 되나 전자나 수소원자에 의해 전자가 쌍이 되어 비라디칼이 되면 특유의 색이 사라지게 되는 2,2-diphenyl- 1-picrylhydrazyl의 화학적 성질을 이용한 방법으로 각 시 료 0.2 mL에 ethanol을 사용하여 용해시킨 0.4 mM DPPH 용액 0.8 mL을 첨가하여 혼합한 뒤 10분 동안 반응시킨 후 microplate reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) 를 사용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다30).

    Ferric ion reducing antioxidant power (FRAP) 측정

    FRAP 방법은 Fe3+가 환원되어 Fe2+가 되어 TPTZ와 결 합하여 blue 계열의 색을 나타내어 환원력을 흡광도 값으 로 나타내는 방법이다. 300 mM sodium acetate buffer (pH 3.6), 10 mM TPTZ, 20 mM ferric chloride를 10:1:1로 혼 합하여 혼합용액 1.5 mL, 시료 50 μL, 증류수 150 μL를 혼 합하여 37°C에서 4분간 반응시킨 후 microplate reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 사용하여 595 nm에서 흡광도를 측정하였다31).

    추출공정의 최적화를 위한 실험계획

    녹차와 애엽 혼합물의 추출공정 최적화를 위해 Box- Behnken design (3 level 3 factor)을 이용하였으며32), 추출 공정에 영향을 주는 녹차 및 애엽의 혼합비(60-100%, X1), 용매 용질의 비(20-100 mL/g, X2), 추출시간(25-145 min, X3)을 독립변수로 설정하여 축값을 포함한 3수준(−1, 0, 1) 에서 실험을 설계 하였다(Table 1). 추출물의 결과는 추출 수율을 종속변수로 하여 실험모델을 작성하고 모델식의 적합성을 평가하였다.

    통계분석

    모든 실험결과는 3회 이상 반복하여 실시하였으며 SAS 9.2를 이용하여 one-way ANOVA 분석을 수행하였고 평균 값의 통계적 유의성은 p < 0.05 수준에서 검정하였으며 실 험 설계와 반응표면분석은 MiniTab (MiniTab 16, Minitab Inc., State college, PA, USA)을 사용하였다33). 반응표면분 석은 독립변수 Xi와 Xj 에 대한 종속변수 Y(추출수율)는 다음과 같은 2차 회귀식으로 나타내었으며, β0는 상수이 고 βi, βii, βij는 회귀계수이다.

    Y = β 0 + i = 1 k β i X i + i = 1 k β ii X i 2 + i = 1 k 1 j = i + 1 k β ij X i X j

    Results and Discussion

    추출조건에 따른 추출물의 품질특성

    초음파 세기에 따른 변화를 확인하기 위하여 녹차와 애 엽의 비, 용매 용질의 비, 온도 및 시간을 동일하게 한 조 건에서 초음파 세기(0, 25, 50, 75, 100%)를 다르게 하여 추출한 결과, 총 페놀 함량과 DPPH 및 FRAP에서 보여 주는 항산화 활성 모두 초음파 세기가 증가함에 따라 함 께 증가하였으며, 초음파의 세기가 100%일 때 가장 높은 30.14 mg GAE/g의 총 페놀 함량과 DPPH와 FRAP에서 각 각 64.31%, 1.28의 항산화 활성을 보여주었다(Fig. 1, Table 2). 초음파를 이용한 추출방법은 공동현상에 의해 식물의 단단한 세포벽을 쉽게 파괴 할 수 있어 생리활성 성분 추 출에 용이하다. 초음파를 이용하여 먼나무를 추출한 Zhao 등34)에 의하면 초음파를 적용 하였을 때 syringin의 함량 이 9.20 mg/g으로 초음파를 적용하기 전 6.22 mg/g보다 syringin 함량이 증가하였으며, Tian 등35) 연구결과에서도 초음파 세기가 증가함에 따라 석류 씨로부터 추출되는 기 름의 수율이 함께 증가하였다.

    온도에 따른 영향을 확인하기 위해서 초음파를 처리하 지 않고 각각 30, 50, 70°C에서 1시간동안 3분 단위로 추 출한 추출물의 DPPH 라디칼 소거 활성을 평가하여 시간 과 온도에 따른 추출물의 변화를 관찰하였다. 그 결과, 6 분 이후부터는 동일시간 추출하였을 때 추출 온도가 높을 수록 더 높은 항산화 활성을 나타내었으며, 추출 시간이 지나감에 따라 30°C 조건에서는 항산화 활성이 계속 증가 하는 반면, 50°C와 70°C의 온도 조건에서는 50분 이후부 터 큰 변화를 보이지 않았다(Fig. 2). Lee 등36)은 로즈마리 의 최적 추출조건 확립을 위해 30~90°C를 7구간으로 나 누어 각각의 온도조건에서 60분간 열수 추출하여 추출물 의 항산화 활성을 평가한 결과, 온도가 증가함에 따라 항 산화 활성과 총 폴리페놀 함량이 함께 증가하였으며, 연 구결과를 근거하여 열수 추출의 최적 추출 조건을 90°C, 30분으로 결정하였다. 일반적으로 추출온도와 시간이 증 가할수록 추출수율 또한 함께 증가하지만37), 반대로 적절 하지 못한 추출온도는 수율의 감소뿐만 아니라 유효성분 을 파괴시키기도 한다38).

    항산화 활성이 증가하는 것은 항산화와 관련된 유효성 분의 추출속도 변화를 관찰할 수 있는 간접적인 지표로서 위 실험결과를 통하여 녹차 및 애엽 혼합물을 추출하는데 있어 초음파와 추출온도 및 시간이 추출조건에 있어 중요 한 요인으로 작용하는 것을 확인하였다.

    Box-Behnken design을 이용한 실험설계

    녹차와 애엽의 추출조건을 최적화하기 위해서 MiniTab (MiniTab 16, Minitab Inc., State college, PA, USA) 소프 트웨어를 통해 반응표면분석법을 사용하였다. 추출조건에 대한 실험계획은 Box-Behnken design을 사용하였으며, Table 1과 같이 녹차 및 애엽의 혼합비(X1), 용매 용질의 비(X2), 추출시간(X3)을 녹차 및 애엽 혼합 추출공정에서 의 중요 변수로 선택하여 각 독립변수를 −1, 0, 1의 3수 준으로 부호화 하고 15구간의 추출실험계획을 설정하여 실험계획을 설계하였다(Table 3). 추출수율의 결과는 Table 3과 같고 결과를 이용한 반응모델식은 Table 4에 나타내 었다. 모델식은 Box-Behnken design 모델에 실험 데이터 를 맞추어 얻은 것이며, 반응(추출수율)사이의 경험적 관 계를 나타낸다. 다항식 모델의 일반적인 유효성 및 정확 성을 암시하고 모델의 적합성을 나타내는 결정계수(R2) 값 은 0.9747이였으며, 1%이내의 유의수준에서 유의성이 인 정되었다. 또한, 모델식에 각 실험조건을 대입하여 얻은 예상치(predicted value)는 Fig. 3와 같이 시계열도를 통하 여 실제값(actual value)과 일치하는 것을 확인하였다.

    모델의 적합성은 자료분석의 구성요소 중 필수적인 부 분으로 Table 5와 같이 분산분석을 수행하여 반응모델의 적합성뿐만 아니라 각 항의 계수와 유의성에 대해 확인하 였다(Table 5). 그 결과, 일차항과 이차항은 유의적인 수준 (p < 0.05)을 보여주었으나 상호항은 통계적으로 유의하지 않아 독립변수 간의 상호작용은 이루어 지지 않는 것으로 판단되었다(p > 0.1). 일차항 중 X1와 X2의 p-value가 각각 0.007와 < 0.0001로 본 실험의 반응모델에서 큰 중요도를 갖고 있으며, 특히 X2의 p-value는 0.0001보다 작은 값으 로 F-value에 noise가 생길 확률이 1%도 되지 않는 높은 유의성을 보여주었다. 적합성 결여(lack of fit)는 반응모델 에서 변수와 실험 요인의 함수 관계가 적절하게 설명되지 못하는 경우 p-value가 0.05보다 작은 값을 나타내며, 올 바른 반응모델은 0.05보다 큰 값을 갖는다39). 본 실험을 통해 얻어진 반응모델은 0.133의 p-value를 나타내어 분산 분석 절차에서 얻어진 모델이 적절하다는 것을 확인할 수 있었다(Table 5).

    반응표면분석법을 이용한 녹차 및 애엽 혼합물의 최적추 출조건

    Box-Behnken design에 따른 15개 구간에서 녹차 및 애 엽 혼합물의 추출수율을 측정한 결과는 19.25~30.00%의 범위로 측정되었으며, MiniTab 16 program을 이용하여 반 응모델의 회귀방정식을 계산하였고 이 회귀방정식으로부 터 각 변수의 최적화된 값을 얻었다. 최적화된 응답을 위 해서 각각의 변수의 최적화된 값을 결정하고 변수들 간의 상호작용을 분석하여 3차원 반응표면과 2차원 등고선 그 래프로 나타내었다(Figs. 4-5). 초음파를 적용한 녹차 및 애엽 혼합물 추출시 추출시간의 level을 0으로 고정하여 녹차와 애엽의 혼합비와 용매와 용질의 비에 따른 추출수 율를 확인한 결과, 녹차의 함량과 추출용매의 양이 증가 할수록 추출수율이 증가하는 것을 확인하였다. 반면, 녹차 와 애엽의 혼합비 또는 용매와 용질의 비를 level 0으로 고정하고 추출시간에 따른 추출수율을 확인한 결과, 추출 시간은 결과에 큰 영향을 주지 않는 것으로 나타났다. Kim 등40) 썸머파워 양배추 유용성분의 추출조건 최적화 연구 에서 시료에 대한 용매비가 증가할수록 수율이 증가하였 다는 보고와 유사한 경향을 나타내었다. Kim 등30) 사과 pomace로부터 폴리페놀 추출조건 최적화 연구에서도 추출 시간이 수율에 큰 영향을 주지 않는 것으로 보고되었다. 본 연구에서 MiniTab 16 program을 사용하여 산출된 녹차 및 애엽 혼합물의 최적 추출조건은 녹차와 애엽의 혼합비 85.86%, 용매와 용질의 비 92.73 mL/g, 추출시간 56.52분 으로 확인되었으며, 추출수율의 최대값은 30.03%로 예측 되었다.

    국문요약

    본 연구는 초음파 진동에 의해 발생하는 공동현상을 이 용하여 다양한 유용성분과 생리활성을 가지고 있는 녹차 와 애엽을 혼합하여 새로운 식품소재를 개발하기 위해서 반응표면분석법에 의한 추출특성을 모니터링 하여 최적 추출조건을 예측하였다. 초음파를 지속적으로 가하는 조 건에서 Box-Behnken design에 의해 녹차와 애엽의 혼합비, 용매와 용질의 비, 추출시간을 독립변수로 하여 15구간의 추출조건을 설정하고 추출수율(Y)을 종속변수로 하여 모 니터링 하였다. 반응표면분석결과 녹차 및 애엽 혼합 추 출물은 녹차의 함량과 추출용매의 양이 증가 할수록 추출 수율이 증가 하였으며, 추출시간은 결과에 큰 영향을 주 지 않는 것으로 나타났다. 추출수율을 최대로 얻을 수 있 는 녹차 및 애엽 혼합물의 최적 추출조건은 녹차와 애엽의 혼합비 85.86%, 용매와 용질의 비 92.73 mL/g, 추출시간 56.52분으로 확인되었으며, 추출수율의 최대값은 30.03% 로 예측되었다.

    Figure

    JFHS-31-4-278_F1.gif

    Effect of different ultrasound power on antioxidant activity. (A) DPPH radical scavenging activity (B) FRAP activity.

    JFHS-31-4-278_F2.gif

    Antioxidant activity of Camellia sinensis L. and Artemisia argyi mixture extracts with various times at different temperature.

    JFHS-31-4-278_F3.gif

    Time series values of extraction yield.

    JFHS-31-4-278_F4.gif

    Response surface for the effects of extraction conditions on extraction yield by ultrasound-assisted extraction.

    JFHS-31-4-278_F5.gif

    Contour for the effects of extraction conditions on extraction yield by ultrasound-assisted extraction.

    Table

    Independent variables and their levels for Box-Behnken design

    Total phenolic contents of Camellia sinensis L. and Artemisia argyi mixture extracts with different ultrasound power

    1)GAE, gallic acid equivalen, Mean ± S.D in triplicate (p < 0.05)

    Box-Behnken design for independent variables and their extraction yield

    Response surface model for optimization of extraction conditions

    X1, Mixture ratio (Camellia sinensis L. %); X2, Ratio of water to raw material (mL/g); X3, Extraction time (min); Y, Extraction yield (%)

    Analysis of variance of the experimental results of Box-Behnken design

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