:: Journal of Food Hygiene and Safety ::
Journal Search Engine
Search Advanced Search Adode Reader(link)
Download PDF Export Citaion korean bibliography PMC previewer
ISSN : 1229-1153(Print)
ISSN : 2465-9223(Online)
Journal of Food Hygiene and Safety Vol.32 No.3 pp.234-242
DOI : https://doi.org/10.13103/JFHS.2017.32.3.234

Changes in Antioxidant and Antiobesity Activities of Cirsium setidens Nakai Ethanolic Extract Depending on Different Harvest Time

Bong-Yeon Cho , Jin-Ha Lee , Sun-Il Choi , Tae-Dong Jung , Seung-Hyun Choi , Moon-Jin Ra1, Sun-Young Kim1, Il-Jun Kang2, Kyoung-Chan Han3, Ok-Hwan Lee*
Department of Food Science and Biotechnology, Kangwon National University, Chuncheon, Korea
1Hongcheon Institute of Medicinal Herb, Hongcheon, Korea
2Department of Food Science and Nutrition, Hallym University, Chuncheon, Korea
3HATTI Co., Ltd., Hongcheon, Korea
Correspondence to: Ok-Hwan Lee, Department of Food Science and Biotechnology, Kangwon National University, Chuncheon 24341, Korea 82-33-250-6454, 82-33-259-5565loh99@kangwon.ac.kr
March 28, 2017 April 13, 2017 May 16, 2017

Abstract

This study was conducted to provide basic data of Cirsium setidens Nakai in different harvest time that will be applied for development of functional foods and ingredients. We investigated pectiolinarin and pectolinarigenin content, total flavonoids content and antioxidant effects (DPPH radical scavenging activity and ORAC assay) of C. setidens Nakai. Our results showed that the pectolinarin and total flavonoids contents of C. setidens Nakai in harvesting time ranged from 43.13 ± 0.22 to 95.65 ± 0.34 mg/g and from 32.81 ± 1.68 to 40.43 ± 0.35 mg rutin equivalent (RE)/g, respectively. The DPPH radical scavenging activity of C. setidens Nakai did not show differences in harvesting time. The oxygen radical absorbance capacity (ORAC) value was highest in August (2016) extracts (827.72 μmole TE/g). In addition, C. setidens Nakai exthanolic extract in harvesting time did not show any cytotoxicity up to 200 μg/mL. During adipocyte differentiation, C. setidens Nakai extract in harvesting time significantly inhibited lipid accumulation and ROS production, compared with the controls. These results suggest that C. setidens Nakai extract could be considered as a non-toxic natural resources of functional food ingredients and natural antioxidants.


수확시기별 고려엉겅퀴 주정추출물의 항산화 및 항비만 활성 비교

조 봉연 , 이 진하 , 최 선일 , 정 태동 , 최 승현 , 라 문진1, 김 선영1, 강 일준2, 한 경찬3, 이 옥환*
강원대학교 식품생명공학과
1홍천메디칼허브연구소
2한림대학교 식품영양학과
3(주)하티

초록

본 연구에서는 국내산 고려엉겅퀴를 건강기능식품 소재 로 활용 시 기초자료 제공하고자 수확시기에 따른 고려엉 겅퀴의 항산화활성 및 항비만 활성의 차이를 구명하고자 수행 하였다. 2016년 6월, 7월 그리고 8월에 수확한 고려 엉겅퀴를 이용하여 지표성분 분석, 총 플라보노이드 함량, DPPH 라디칼 소거활성, ORAC assay 및 지방축적과 ROS 생성 억제효과를 관찰하였다. 지표성분 pectolinarin 함량 은 수확시기별로 43.13 ± 0.22 ~ 95.65 ± 0.34 mg/g 로 수확 시기 가운데 2016년 8월에 수확한 고려엉겅퀴에서 가장 높은 함량을 보였으며 총 플라보노이드 함량의 경우 2016 년 8월에 수확한 고려엉겅퀴 주정추출물에서 40.43 ± 0.35 mg RE/g로 수확시기 가운데 가장 높은 함량을 나타냈다. DPPH 라디칼 소거활성은 수확시기에 따른 활성 차이를 보이지 않았지만 ORAC 지수의 경우 총 플라보노이드 및 지표성분 함량의 결과와 유사하게 2016년 8월에 수확한 고려엉겅퀴 주정추출물에서 6월 수확시기보다 2.4배가량 높은 ORAC 지수를 나타내었다. 수확시기별 고려엉겅퀴 주정추출물은 50~200 μg/mL의 농도에서 지방세포에 대한 세포독성을 나타내지 않았으며 지방세포 분화 중 세포 내 지방축적 및 ROS 생성량을 비교한 결과, 수확시기별 고 려엉겅퀴 주정추출물을 처리한 지방세포의 경우 지방축적 량과 ROS 생성량 모두 유의적으로 억제되는 것으로 나타 났다. 따라서 고려엉겅퀴는 비만 등 대사증후군 관련 질 환의 개선을 위한 건강기능식품 소재로의 활용이 기대된다.


    Ministry of Trade, Industry and Energy
    R00004762

    비만은 열량 섭취와 에너지 소비의 불균형으로 발생하 는 대사성 질환으로 심혈관계 질환을 비롯한 제 2형 당뇨 병 등과 같은 만성 질환의 발생 가능성을 증가시키는 주요 요인으로 인류 건강을 위협하고 있다1). 비만을 치료하기 위해서는 약물요법 뿐만 아니라 식이요법, 운동요법들을 병행하게 되면 좋은 효과를 나타내며, 그 중에서도 식이 요법은 비만의 예방과 치료를 하는데 있어 가장 중요하고 근본적인 방법이라고 알려져 있다2,3). 식욕, 지방흡수 억제 및 지방산화 조절 등을 통해 비만환자를 치료하기 위해 많은 비만 치료 약물이 개발이 되었지만 낮은 효능 및 불 면증, 두통, 메스꺼움 등의 부작용이 발생하여 많은 치료 제들이 시장에서 회수되었다4,5). 현재는 항비만 효능을 나 타내는 기능성 식품 소재에 관한 연구가 활발하게 이루어 져 Park 등6)은 흑마늘 열수추출물이 지방세포의 분화과정 에서 중요한 역할을 하는 adipogeneic transcription factor의 발현을 효과적으로 억제하며 lipid droplet 및 triglyceride 생성을 효과적으로 억제시켜 지방세포로의 분화를 막는 항 비만 효능을 가질 수 있음을 확인한 바 있으며 Kim 등7) 은 후박 추출물이 지방 세포로의 분화에 관여하는 유전인 자를 억제하여 분화를 억제하며, HSL (Hormone sensitive lipase) 발현의 증가로 인해 성숙된 지방세포가 생성한 triglyceride의 분해를 촉진하여 항비만 효과를 가진다고 보 고한 바 있다.

    고려엉겅퀴(Cirsium setidens Nakai)는 국화과(Asteraceae) 에 속하는 다년생의 초본으로 주로 강원도 지역에 분포하 며 그 맛이 담백하고 향이 독특하여 예로부터 빈궁기에 곤드레 밥을 지어 부족한 식량을 해결하는 구황식품으로 활용되어 왔다8). 구황식물로서 활용되었던 고려엉겅퀴가 최근 건강식품의 원료로 관심이 높아지면서 고려엉겅퀴의 다양한 기능성이 밝혀졌으며 Yoo 등9) 은 고려엉겅퀴의 지 표성분은 pectolinarin 및 비배당체의 형태인 pectolinarigenin 으로 보고한 바 있고, Noh 등10)은 고려엉겅퀴가 고지방식 이를 섭취한 쥐로부터 무알콜성 지방간의 간 지방축적 억 제작용에 효능이 있다고 보고한바 있다. 이처럼 고려엉겅 퀴의 다양한 기능성이 밝혀지면서 건강기능식품 소재로서 의 활용방안이 요구되고 있다.

    고려엉겅퀴를 사용하여 건강기능식품을 개발하기 위해 서는 원료의 표준화를 통한 소재의 기능성과 안전성을 평 가하는 것이 중요하며 재배산지와 수확시기의 차이에 따 른 지표성분의 함량분석 생산 단계별 공정 조건별 지표성 분의 함량분석 등 건강기능식품 원료의 표준화와 규격화 를 하는 것 매우 중요하다11). 고려엉겅퀴의 보통재배의 경 우 5월 중순부터 수확하여 생채나 삶은 후 건조하여 식용 으로 사용하는 것이 일반적이나 일부에서는 비닐하우스를 활용하여 조기에 재배와 수확기를 연장시켜 보통 5~9월 사이에 수확을 하는 것으로 알려져 있다12). 식물의 경우 수확시기 차이에 의해 생리활성과 유용성분의 함량이 크 게 좌우됨을 고려했을 때 수확시기별 고려엉겅퀴의 유용 생리활성 변화 및 지표성분 변화에 대한 연구가 필요하지 만 아직 보고된바 없으며 생리활성평가의 경우 항산화 활 성에 한정되어있는 실정이다13,14).

    따라서 본 연구에서는 고려엉겅퀴를 건강기능식품 소재 의 원재료 표준화를 위한 기초자료를 제공하고자 하였으 며 6월에서 8월 사이에 수확된 고려엉겅퀴 주정추출물의 지표성분 및 유용생리활성 변화를 관찰하기위해 pectolinarin 함량분석과 이에 따른 총 플라보노이드 함량, DPPH 라디 칼 소거능, ORAC (oxygen radical absorbance capacity) assay, 항비만 활성을 조사하였다.

    Materials and Methods

    실험재료 및 시약

    본 연구에 사용한 고려엉겅퀴(Cirsium setidens Nakai)는 (주)하티(Hongcheon, Korea)로부터 2016년 6월부터 2016 년 8월에 수확된 고려엉겅퀴를 제공받아 사용하였다. 각 각의 시료는 음건 후 분쇄한 것을 사용하였으며, 분쇄된 시료는 5 g 당 200 mL의 40% ethanol (EtOH)을 혼합한 뒤 70°C에서 2시간 추출하였다. 각 추출액은 filter paper로 여과한 후 rotary vacuum evaporator를 이용하여 용매를 제거하였으며 농축물은 동결 건조하였다. 최종 수확시기 별 고려엉겅퀴 주정추출물 분말은 일정 농도로 희석하여 실험에 사용하였다. 수확시기별 고려엉겅퀴 주정추출물의 항산화활성과 항비만활성 조사에 사용된 2,2-diphenyl-1- picrylhydrazyl (DPPH), 2,2'-azobis(2-methylpropionamidine) dihydrochloride (AAPH) 등은 Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였으며, pectolinarin 표준물질 (purity ≥ 98.0%)은 Carbosynth (Compton, Berkshire, UK) 에서 pectolinarin의 비배당체 형태인 pectolinarigenin은 Chengdu Biopurify Phytochemicals Ltd. (Chengdu, Sichuan, China)에서 구입하였다. HPLC 분석에 사용된 acetonitrile 은 J.T. Baker (Phillipsburg, NJ, USA)에서, trifluoroacetic acid는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였고 dimethyl sulfoxide (DMSO)는 Junsei Chemical (Tokyo, Japan)에서 구입하여 사용하였다. 3T3-L1 세포배 양 및 분화에 사용된 N-acetyl-L-cysteine (NAC), insulin, dexamethasone (DEX), 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX), nitroblue tetrazolium (NBT), Oil Red O (ORO), isopropanol 은 Sigma (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였고, Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), bovine serum (BS), fetal bovine serum (FBS), penicillinstreptomycin (P/S), phosphate-buffered saline (PBS) 및 trypsin-EDTA는 Gibco (Gaithersburg, MD, USA)로부터 구 입하여 사용하였다.

    Pectolinarin과 pectolinarigenin 함량 분석

    수확시기별 고려엉겅퀴 주정추출물의 pectolinarin 및 pectolinarigenin의 분석을 위하여 Oh 등15)의 방법을 변형 하여 실시하였으며 서로 다른 두 개의 표준물질을 동시분 석 하였다. 분석에 사용한 기기는 Waters 2695 Separation Module HPLC system과 Waters Photodiode Array Detector (Waters Co., Milford, MA, USA)로 조건은 Table 1과 같 으며 분석용 column은 SunfireTM C18 (4.6 mm × 250 mm, 5.0 μm, Waters Co., Milford, MA, USA)을 사용하였다.

    총 플라보노이드 함량 분석

    총 플라노이드 함량은 Kim 등16)의 방법을 일부 변형하 여 측정하였다. 시료 0.5 mL에 95% 에탄올 1.5 mL을 첨 가한 후 10% aluminium nitrate 0.1 mL, 1 M potassium acetate 0.1 mL와 증류수 2.8 mL를 혼합하여 상온에서 30 분간 방치하였다. 다음 microplate reader (Spectramax i3, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 415 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로 rutin을 이용하였 으며 표준 검량 곡선(y = 1.7408x − 0.0027 R2 = 0.9998)으로 부터 총 플라보노이드 함량을 계산하였다.

    DPPH 라디칼 소거활성 측정

    DPPH 라디칼 소거활성 측정은 Kim 등17)의 방법을 변 형하여 측정하였다. 시료 0.2 mL에 ethanol로 용해한 0.4 mM DPPH 용액 0.8 mL를 첨가하여 혼합한 후 상온에서 10분간 반응하였다. 그리고 microplate reader를 사용하여 517 nm에서 흡광도 값을 측정한 후 시료의 DPPH 라디칼 소거활성은 다음 식에 의해 나타내었다.

    DPPH 라디칼 소거활성 ( % ) = { 1 A E x p e r i m e n t A c o n t r o l } × 100

    ORAC 지수 측정

    ORAC 지수 측정은 Ou 등18)의 방법을 변형하여 측정하 였다. 시료의 농도별 희석은 75 mM sodium phosphate buffer (pH 7.4)를 이용하였다. Black well plate에 시료 25 μL, 40 nM fluorescein 150 μL을 첨가하고 측정 직전에 150 mM AAPH 25 μL을 첨가한 다음 microplate reader를 이용하여 485 nm에서 전자여기 후 530 nm에서 방출되는 조건으로 37°C에서 90분간 3분마다 fluorescence의 감소율을 측정하 였다. 결과 값은 시료 첨가구와 무 첨가구의 area under curve (AUC) 값을 나타낸 후, 표준물질인 Trolox를 이용 하여 표준 검량 곡선(y = 1.2127x + 0.5667 R2= 0.9941)에 대입하여 나타내었다.

    Area under curve  ( AUC ) = 1 + f 1 / f0+f2/f 0 + f 3 / f 0 + f 4 / f 0 + ... f / 31 / f 0

    XTT assay를 이용한 세포독성평가

    3T3-L1 지방세포에 대한 수확시기별 고려엉겅퀴 주정추 출물의 세포 독성평가는 Kim 등19)의 방법에 따라 XTT {2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5- carboxanilide innersalt} assay kit를 이용하여 측정하였다. 3T3-L1 세포는 1 × 106 cell 농도로 48-well plate에 seeding 하고 BS (10%) 및 P/S (1%)를 함유한 DMEM (89%)에서 100% confluence 될 때까지 배양하였다. 이로부터 2일 후 에, 지방세포 분화유도 물질(1 μg/mL insulin, 250 nM DEX, 0.5 mM IBMX)과 FBS (10%) 및 P/S (10%)를 함유한 DMEM으로 전지방세포를 지방세포로 분화유도 하였다. 지방세포 분화(day 0)시 각각의 시료를 50, 100 및 200 μg/ mL 농도로 처리하였다. 분화 6일차가 되었을 때 1 mL의 XTT reagent와 20 μL PMS reagent (N-Methylphenazonium methyl sulfate)를 혼합하여 working solution을 준비하여 놓고, pipet을 이용하여 48-well medium 부피의 20% 되는 양 만큼 취하고 각각의 well에 조심스럽게 첨가하여 plate 를 바닥에 붙인 상태로 가볍게 흔들면서 혼합하였다. 4시 간 동안 CO2 incubator에서 배양한 후, microplate reader를 이용하여 450 nm 흡광도 값에서 690 nm의 흡광도 값을 뺀 결과 값으로 세포 독성을 계산하였다.

    3T3-L1 세포 배양 및 분화

    3T3-L1 지방세포의 분화 과정 중, 수확시기별 고려엉겅 퀴 주정추출물에 의한 지방세포 분화를 관찰하기 위해 사 용된 마우스 유래 3T3-L1 세포주는 American Type Culture Collection (ATCC, CL-173, Manassas, VA, USA)으로부터 분양 받아 사용하였다. 3T3-L1 전지방세포를 실험목적에 따라 24-well plate에 각각 5 × 106 cell 농도로 seeding한 후, 10% BS 및 1% P/S를 함유한 DMEM (89%)에서 100% confluence 될 때까지 배양하였다. 이로부터 2일 후에, 지 방세포 분화유도 물질(1 μg/mL insulin, 250 nM DEX, 0.5 mM IBMX)과 10% FBS 및 10% P/S를 함유한 DMEM으 로 전지방세포를 지방세포로 분화 유도하였다. 지방세포 분화(day 0)시 DMEM에 시료를 각각 50 그리고 100 μg/ mL로 처리하였고, 이때 수확시기별 고려엉겅퀴 주정추출 물의 효과를 관찰하기 위하여 negative control에는 아무것 도 처리하지 않았다. 지방세포의 분화는 분화유도 물질을 처리한 후, 2일마다 지속적으로 1 μg/mL insulin, 1% P/S, 10% FBS가 함유된 배지에 각각의 시료를 처리하였다.

    Oil red O staining을 이용한 지방축적량 관찰

    분화 과정에 따른 3T3-L1 세포 내 지방축적량을 측정 하고자 각각의 시료를 처리하여 24-well에서 8일 동안 분 화된 3T3-L1 세포의 배양액을 제거한 후, 10% formalin 용액 500 μL를 첨가하여 5분간 실온에서 방치한 뒤 제거 하였다. 그 후 동량의 formalin 용액으로 분화된 3T3-L1 세포 1시간 이상 실온에서 방치한 후, formalin을 제거하 고 60% isopropanol 용액 500 μL로 세척하여 세포를 완전 히 건조시켰다. 완전히 건조된 세포들은 미리 제조해 둔 ORO working solution (Oil red O:DDW= 6:4)으로 세포 내 축적된 지방성분들을 충분히 염색 한 후, 증류수를 이 용하여 세포를 3~4회 세척하고, 완전히 건조시켰다. 세포 내 축적된 지방 성분과 결합한 Oil red O는 100% isopropanol을 이용하여 모두 용출시킨 후 490 nm에서 흡광도를 측정하였다.

    NBT assay를 이용한 ROS 생성량 관찰

    분화과정에 따른 지방세포의 ROS 생성량을 측정하기 위하여 먼저 24-well에 배양 및 분화된 3T3-L1 세포의 배 양액을 제거한 후 멸균된 PBS (Phosphate buffer saline, pH 7.4)를 이용하여 2회 세척하고 0.2% NBT 용액 200 μL 를 첨가하여 CO2 incubator안에서 90분간 반응시킨 뒤 KOH solution (DMSO:1N KOH = 7:3)을 이용하여 dark blue formazan을 모두 용출시킨 후 동량의 증류수를 첨가하여 잘 섞어준 후 microplate reader (Spectramax i3, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) 570 nm에서 흡광도를 측 정하였다.

    통계처리

    Pectolinarin 함량, 총 플라보노이드 함량, 항산화 활성, 항비만 활성 결과 값의 통계처리는 SAS version 9.4 (SAS institute Inc., Cary, NC, USA)을 이용하여 분석하였다. 유 의성 분석은 one-way ANOVA 검정을 실시하였으며 Duncan 의 다중범위 검정법(Duncan's multiple range test)으로 유 의성은 P < 0.05 수준에서 검정하였다.

    Results and Discussion

    수확시기별 고려엉겅퀴 주정추출물의 pectolinarin 함량

    산지별 고려엉겅퀴의 pectolinarin 함량을 분석한 결과는 Fig. 1과 같이 분석에 사용한 표준물질 pectolinarin 및 pectolinarigenin의 머무름 시간(retention time, RT)과 수확 시기별 고려엉겅퀴 주정추출물의 머무름 시간은 일치하였 다. 수확시기별 고려엉겅퀴 추출물의 지표성분함량은 Fig. 2와 같이 pectolinarin 함량은 수확시기별로 43.13 ± 0.22, 51.96 ± 0.44 및 95.65 ± 0.34 mg/g로 수확시기 가운데 2016 년 8월에 수확한 고려엉겅퀴에서 가장 높은 함량을 보였 으며 pectolinarin의 비배당체인 pectolinarigenin의 함량은 수확시기별로 0.83 ± 0.01, 0.23 ± 0.01 및 0.17 ± 0.01 mg/g 로 나타났다. Lee 등20) 에 따르면 폴리페놀 화합물인 epicathechin, catechin, resveratrol, quercetin 등의 활성 물 질이 포도의 수확시기에 따라 함량차이를 보였는데 이는 일조량 및 생육시기 등의 복합적 요인들이 활성물질 함량 정도에 영향을 주기 때문인 것으로 밝힌 바 있으며 고려 엉겅퀴의 수확시기에 따른 지표성분의 함량 또한 일조량 및 생육시기 등의 특성에 따라서 많은 차이를 보인 것으 로 사료되었다.

    수확시기별 고려엉겅퀴 주정추출물의 총 플라보노이드 함량

    식물에 널리 분포되어있다고 잘 알려진 플라보노이드는 폴리페놀에 속하는 황색계열의 물질로 항산화활성을 비롯 하여 여러 생리활성 기능을 가진 물질이다. 최근 많은 연 구에서 플라보노이드는 항비만, 항염증 등의 반응에 효과 가 있다고 발표한 바 있으며 플라보노이드 성분을 지방전 구세포 분화과정 동안 처리했을 시 분화억제 및 항산화효 과가 있음이 밝혀진 바 있다21,22). 수확시기별 고려엉겅퀴 주정추출물의 총 플라보노이드 함량은 표준물질 rutin (RE) 으로 하여 표준검량곡선을 작성한 후 그 함량을 확인하여 Fig. 3와 같이 나타내었다. 총 플라보노이드 함량은 수확 시기별로 32.81 ± 1.68, 36.05 ± 1.28, 40.43 ± 0.35 mg RE/g 수준으로 측정되었으며 2016년 6월에 수확한 고려엉겅퀴 추출물에서 측정된 총 플라보노이드 함량에 비해 2016년 8월에 수확한 고려엉겅퀴 추출물에서 약 23% 정도 증가 한 것으로 확인되었다. 곰취의 품종 및 수확시기별 생리 활성을 비교한 Seo 등23)의 연구에 따르면 품종별로 총 플 라보노이드 함량이 상이하였지만, 모든 품종에서 6월 중 순 이후 분명한 함량변화를 확인하였으며 7월 초까지 총 플라보노이드 함량이 유의적으로 증가함을 확인한 바 있 다. 본 연구의 고려엉겅퀴의 경우에도 수확시기가 길어짐 에 따라서 총 플라보노이드 함량이 증가함을 확인하여 활 성 물질이 많이 함유되어 있는 고려엉겅퀴를 얻기 위한 최적의 수확시기를 선정하는데 도움이 될 것으로 사료되 었다.

    수확시기별 고려엉겅퀴 주정추출물의 항산화활성 측정 (DPPH 라디칼 소거능, ORAC assay)

    DPPH는 항산화 능력을 측정하는데 있어 대표적인 반응 물질로 그 자체로 매우 안정한 자유 라디칼이며 DPPH 라 디칼 소거능은 하이드록시 라디칼(−OH)을 갖는 페놀성 화 합물이나 플라보노이드를 가진 물질에서 수소공여를 통한 라디칼의 소거로 자색 화합물이 노란색으로 탈색되는 원 리는 이용하는 방법이다24). 수확시기별 고려엉겅퀴의 DPPH 라디칼의 소거능을 확인한 결과는 Fig. 4과 같다. 수확시 기에 따른 고려엉겅퀴 주정추출물의 DPPH 라디칼 소거 활성은 100, 500 및 1000 μg/mL 농도에서 26.02%~64.10% 의 소거활성이 나타났으며 농도 의존적으로 활성이 증가 하는 것을 확인하였다. 동일 농도인 1000 μg/mL 농도에서 수확시기에 따라 64.10 ± 1.74, 60.71 ± 2.44, 63.83 ± 2.46% 의 DPPH 라디칼 소거활성이 나타났으나 통계 유의적으 로 차이는 없는 것으로 확인되었다. Villa .o 등25)은 플라 보노이드 계열의 화합물이 항산화 활성 간 높은 상관관계 를 나타낸다는 보고한 바 있으나 Nabasree 등26)에 따르면 항산화활성은 평가방법에 따라 효과가 상이하며, 항산화 효과와 총 페놀 및 총 플라보노이드 함량간의 상관관계는 시료를 구성하는 유용성분에 따라 다르게 나타난다고 보 고한 바 있다. 본 연구에서는 수확시기에 따른 고려엉겅 퀴의 총 플라보노이드 함량과 DPPH 라디칼 소거능 간의 명확한 상관관계가 보이지 않아 다양한 항산화활성 평가를 이용하여 상호보완적인 기능성 평가를 수행하여 기능성 원 료로서의 자료를 구축하는 것이 필요하다고 판단되었다. 수확시기별 고려엉겅퀴 주정 추출물의 ORAC 지수를 측 정한 결과는 Fig. 5와 같이 수확시기별로 345.69~827.72 μmole TE/g의 값을 나타내었다. 2016년 6월에 수확한 고 려엉겅퀴 추출물에서 측정된 ORAC 지수에 비해 2016년 8월에 수확한 고려엉겅퀴 추출물에서 약 2.4배 가량 증가 한 것으로 확인되었다. ORAC 지수가 총 페놀 함량에 비 례하여 증가한다고 보고한 바 있는 Prior 등27)의 연구결과 와 유사하게 지표성분 함량 및 페놀성 화합물의 일종인 총 플라보노이드 함량에 비례하여 ORAC 지수가 증가하 였으며 그 차이는 수확시기별 고려엉겅퀴 추출물의 페놀 성 화합물의 함량의 차이에 의한 것으로 사료되었다.

    수확시기별 고려엉겅퀴 주정추출물의 지방세포 분화 억제 및 ROS 저감효과

    수확시기별 고려엉겅퀴 주정추출물(Cirsium setidens Nakai ethanolic extract)은 50~200 μg/mL의 농도에서 세포 독성을 나타내지 않았으며, 현미경 상에서의 morphology 의 변화도 관찰되지 않았다(Fig. 6). 따라서 수확시기별 고 려엉겅퀴 주정추출물의 항비만 및 항산화 활성을 평가하 기 위한 처리 농도는 50 및 100 μg/mL로 결정하였다. 수 확시기별 고려엉겅퀴 추출물이 3T3-L1 전구지방세포의 분 화 억제에 미치는 영향을 알아보기 위하여 3T3-L1 세포에 수확시기별 고려엉겅퀴 추출물을 농도별로 MDI(분화유도 배지)와 동시에 처리하면서 adipocyte로 분화를 유도시키고 세포 내에 형성된 중성지방을 붉게 염색시키는 Oil red O 시약을 통해 중성지방의 양을 측정한 결과는 Fig. 7와 같 다. 음성대조군(CON)에 비해 수확시기별 고려엉겅퀴 주 정추출물을 각각 100 μg/mL 처리한 군에서 각각 75.72 ± 2.99, 73.98 ± 3.57, 및 69.88 ± 1.49% 로 세포 내 지질 축 적량이 감소한 것을 확인하였으며 수확시기에 따른 고려 엉겅퀴 추출물의 지질 축적 억제능의 차이는 미비한 것으 로 확인되었다. 이는 항비만 효과를 확인하기위해 사용된 고령엉겅퀴 주정추출물의 경우 단일성분이 아닌 복합추출 물 형태로 처리하였기 때문에 수확시기에 따른 고려엉겅 퀴 주정추추물의 유효성분 차이로 인한 항비만 효과는 미 비하였던 것으로 사료되었다. 그러나 고려엉겅퀴 열수추 출물의 지방세포 분화 억제를 보여주는 선행연구결과와 유사하게 수확시기별 고려엉겅퀴 주정추출물 또한 3T3-L1 지방세포에 처리하였을 때 지방생성이 효과적으로 억제되 는 연구결과를 보였으며 이는 지방세포의 분화 및 지방축 적과 연관된 주요 전사인자인 PPARγ, C/EBPα 및 aP2의 발현과 관련이 있을 것으로 사료되었다28).

    지방세포 내 생성된 ROS를 측정할 수 있는 NBT assay 는 NBT 시약과 ROS가 반응하여 dark blue formazan을 생성하고, 이를 용출시켜 세포 내 ROS의 생성량을 알 수 있는 방법이다. ROS는 3T3-L1 지방세포 내 대사과정에서 발생하는 NADPH를 이용하여 ROS를 생성하는 단백질 NADPH oxidase 4 (NOX4)에 의해 생성된다29,30). 3T3-L1 전구지방세포에 분화유도물질 및 수확시기별 고려엉겅퀴 주정추출물을 처리하여 분화시킨 뒤 NBT assay를 통해 ROS 생성량을 측정한 결과는 Fig. 8과 같다. 음성대조군 에 비하여 수확시기별 고려엉겅퀴 주정추출물 100 μg/mL 처리한 군에서 ROS 생성량이 각각 18.83, 14.91 및 15.30% 정도 감소하는 것을 확인하였다. 글루타치온의 전구체로서 세포 내 항산화 효소 생성에 도움을 준다고 알려져 있는 NAC의 경우 지방축적 억제효과와 유사하게 ROS의 생성 량을 유의적으로 감소시키는 것으로 나타났다. Lee 등28) 은 고려엉겅퀴 열수추출물을 3T3-L1 지방세포에 처리하 였을 때 대조군에 비해 약 17.2% 정도 감소한 ROS 생성 량을 확인한 바 있으며 주요 전사인자 가운데 ROS 생성 과 관련한 G6PDH의 단백질 발현이 고려엉겅퀴 열수추출 물을 처리한 군에서 유의적으로 감소하였다는 결과를 발 표한 바 있다. 이상의 결과로 비추어 볼 때, 고려엉겅퀴 주정추출물은 지방세포 분화과정 및 ROS의 생성을 억제 하는 효능을 갖는 것으로 판단되었으며, 추후 고려엉겅퀴 주정추출물에 대한 항비만, 항산화활성의 기초자료로 향 후 본 연구를 바탕으로 하여 항비만 활성의 작용기작 구 명 및 주요 활성성분의 분리, 정제 연구 등이 이루어진다 면 고려엉겅퀴를 이용한 천연 항비만 건강기능식품을 개 발하는데 도움이 될 것으로 사료된다.

    Acknowledgement

    본 연구는 산업통상자원부와 한국산업기술진흥원의 “지 역특화산업육성사업”(과제번호 R00004762)으로 수행된 연 구결과 입니다.

    Figure

    JFHS-32-234_F1.gif

    HPLC chromatograms of standard mixture and C. setidens Nakai ethanolic extract at different harvesting times. A, Standard mixture compound; B, June (2016); C, July (2016); D, August (2016). (1): pectolinarin, (2): pectolinargenin.

    JFHS-32-234_F2.gif

    The contents of pectolinarin and pectolinarigenin of C. setidens Nakai ethanolic extract at different harvesting times. Results are presented as the mean ± SD of 3 independent in triplicate. Means with different letters on the same kind of bars are significantly different at p < 0.05 by Duncan's multiple range test.

    JFHS-32-234_F3.gif

    Comparison of total flavonoid contents of C. setidens Nakai ethanolic extract at different harvesting times. Total flavonoid contents expressed as rutin equivalents (mg RE/g). Results are presented as the mean ± SD of 3 independent in triplicate. Means with different letters on the same kind of bars are significantly different at p < 0.05 by Duncan's multiple range test.

    JFHS-32-234_F4.gif

    Comparison of DPPH radical scavenging activity of C. setidens Nakai ethanolic extract at different harvesting times. Results are presented as the mean ± SD of 3 independent in triplicate. Means with different letters on the same kind of bars are significantly different at p < 0.05 by Duncan's multiple range test.

    JFHS-32-234_F5.gif

    Comparison of ORAC value of C. setidens Nakai ethanolic extract at different harvesting times. ORAC values expressed as Trolox equivalents (μmole TE/g). Results are presented as the mean ± SD of 3 independent in triplicate. Means with different letters on the same kind of bars are significantly different at p < 0.05 by Duncan's multiple range test.

    JFHS-32-234_F6.gif

    Effect of C. setidens Nakai ethanolic extract at different harvesting times on cell viability. Cell viability was measured by XTT assay. 3T3-L1 preadipocytes were incubated in differentiation medium with C. setidens Nakai extract at different harvesting times. After 6 days, XTT reagent was added to the medium. After 4 hours of incubation, the absorbance was read at 570 nm. XTT Results are presented as the mean ± SD of 3 independent in triplicate. Means with different letters on the same kind of bars are significantly different at p < 0.05 by Duncan's multiple range test.

    JFHS-32-234_F7.gif

    Effect of C. setidens Nakai ethanolic extract at different harvesting times on lipid accumulation during adipogenesis of 3T3-L1 preadipocytes. Oil red O staining at day 6. Lipid accumulation determined by absorbance at 490 nm (Abbreviation: CON; Control, NAC; N-acetyl cysteine). Results are presented as the mean ± SD of 3 independent in triplicate. Means with different letters on the same kind of bars are significantly different at p < 0.05 by Duncan's multiple range test.

    JFHS-32-234_F8.gif

    Effect of C. setidens Nakai ethanolic extract at different harvesting times on ROS production during adipogenesis of 3T3- L1 preadipocytes. Dark-blue formazan (ROS production) was dissolved and the absorbance was determined at 570 nm (Abbreviation: CON; Control, NAC; N-acetyl cysteine). Results are presented as the mean ± SD of 3 independent in triplicate. Means with different letters on the same kind of bars are significantly different at p < 0.05 by Duncan's multiple range test.

    Table

    HPLC conditions of pectolinarin and pectolinarigenin analysis for C. setidens Nakai ethanolic extract at different harvesting times

    1)TFA: trifluoroacetic acid

    Reference

    1. Spiegelman BM , Flier JS (2001) Obesity and the regulation of energy balance , Cell, Vol.104 ; pp.531-543
    2. King DJ , Devaney N (1988) Clinical pharmacology of sibutramine hydrochloride (BTS 54524), a new antidepressant, in healthy volunteers , Br. J. Pharmacol, Vol.26 ; pp.607-611
    3. Mason EE (1992) Methods for Voluntary Weight Loss and Control , Obes. Surg, Vol.2 ; pp.275-276
    4. Elangbam CS (2009) Review paper: Current strategies in the development of anti-obesity drugs and their safety concerns , Vet. Pathol, Vol.46 ; pp.10-24
    5. Rodgers RJ , Tschop MH , Wilding JP (2012) Anti-obesity drugs: past, present and future , Dis Model Mech, Vol.5 ; pp.621-626
    6. Kim HJ , Lee YM , Kim YH , Won SI , Choi SA , Choi SW (2009) Inhibition of Adipogenesis in 3T3-L1 Adipocytes with Magnolia officinalis Extracts , J. Soc. Cosmet. Scientists Korea, Vol.2 ; pp.117-123
    7. Park JH , Park C , Han MH , Kim BW , Chung YH , Kim YH (2011) Inhibition of Adipocyte Differentiation and Adipogenesis by Aged Black Garlic Extracts in 3T3-L1 Preadipocytes , J. Life. Sci, Vol.5 ; pp.720-728
    8. Park HY , Lim BK (2014) Manufacturing optimization of wet noodle added with leaf powder of freeze-dried Cirsium setidens Nakai , Food Eng. Prog, Vol.18 ; pp.130-139
    9. Yoo YM , Nam JH , Kim MY , Choi J , Park HJ (2008) Pectolinarin and pectolinarigenin of Cirsium setidens prevent the hepatic injury in rats caused by D-galactosamine via an antioxidant mechanism , Biol Pharm Bull, Vol.31 ; pp.760-764
    10. Noh H , Lee H , Kim E , Mu L , Rhee YK , Cho CW , Chung J (2013) Inhibitory effect of a Cirsium setidens extracts on hepatic fat accumulation in mice fed a high-fat diet via the induction of fatty acid β-oxidation , Biosci Biotechnol Biochem, Vol.77 ; pp.1424-1429
    11. (2008) Guideline for standard of health functional food, Korea Food & Drug Administration ,
    12. (2012) Profitability Analysis of Agricultural Production in Region, Rural Development Administration,
    13. Cha JY , Jeong JJ , Kim YT , Seo WS , Yang HJ , Kim JS , Lee YS (2006) Detection of chemical characteristics in hamcho (Salicornia herbace L) according to harvest periods , J. Life Sci, Vol.16 ; pp.683-690
    14. Kim HS , Park JW , Lee YJ , Shin GW , Park IB , Jo YC (2009) The amino acid content and antioxidant activities of glasswort (Salicornia herbacea L) , Kor. J. Food Preserv, Vol.16 ; pp.427-434
    15. Oh JW , Lee JH , Cho ML , Shin GH , Kim JM , Choi SI , Jung TD , Kim YH , Lee SJ , Lee BJ , Park SJ , Lee OH (2015) Development and validation of analytical method for pectolinarin and pectolinarigenin in fermented Cirsium setidens Nakai by bioconversion , J. Korean. Soc. Food Sci. Nutr, Vol.44 ; pp.1504-1509
    16. Kim IS , Yang MR , Lee OH , Kang SN (2011) Antioxidant activities of hot water extracts from various spices , Int. J. Mol. Sci, Vol.12 ; pp.4120-4131
    17. Kim JH , Park JH , Park SD , Choi SY , Seong JH , Hoon KD (2002) Preparation and antioxidant activity of health drink with extract powders from safflower (Carthamus tinctorius L) seed , Kor. J. Food Sci, Vol.34 ; pp.617-624
    18. Ou B , Hampsch-Woodill M , Prior RL (2001) Development and validation of an improved oxygen radical absorbance capacity assay using fluorescein as the fluorescent probe , J. Agric. Food Chem, Vol.49 ; pp.4619-4626
    19. Kim DJ , Jung JH , Kim SG , Lee HK , Lee SK , Hong HD , Lee BY , Lee OH (2011) Antioxidants and Anti-obesity Activities of Hot Water and Ethanolic Extracts from Cheonnyuncho (Opuntia humifusa) , Kor. J. Food Preserv, Vol.18 ; pp.366-373
    20. Lee SK , Kim SK , Hong EY , Chun SH , Son IC , Kim DI (2014) Effect of Harvest Time on the Several Phenolic Compounds and Fruit Quality of Grape Cultivars , Kor. J. Plant Res, Vol.27 ; pp.119-124
    21. Heim KE , Tagliaferro AR , Bobilya DJ (2002) Flavonoid antioxidants: chemistry, metabolism and structure-activity relationships , J. Nutr. Biochem, Vol.13 ; pp.572-584
    22. Hsu CL , Yen GC (2007) Effects of Flavonoids and Phenolic Acids on the Inhibition of Adipogenesis in 3T3-L1 Adipocytes , J. Agric. Food Chem, Vol.55 ; pp.8404-8410
    23. Suh JT , Choi EY , Yoo DL , Kim KD , Lee JN , Hong SY , Kim SJ , Nam JH , Han HM , Kim MJ (2015) Comparative Study of Biological Activities at Different Harvesting Times and New Varieties for Highland Culture of Gom-chwi , Kor. J. Plant Res, Vol.28 ; pp.391-399
    24. Bondet V , Brand-Williams W , Berset C (1997) Kinetics and mechanisms of antioxidant activity using the DPPH. free radical method , LWT-Food Sci. Technol, Vol.30 ; pp.609-615
    25. Villaoñ D , Fernández-Pachón MS , Moyá ML , Troncoso AM , Garca-Parrilla MC (2007) Radical scavenging ability of polyphenolic compounds towards DPPH free radical , Tanlanta, Vol.71 ; pp.230-235
    26. Nabasreem D , Bratati D (2007) Antioxidant activity of some leafy vegetables of India: A comparative study , Food Chem, Vol.101 ; pp.471-474
    27. Prior RL , Cao G , Martin A , Sofic E , McEwen J , O'Brien C , Mainland CM (1998) Antioxidant Capacity As Influenced by Total Phenolic and Anthocyanin Content, Maturity, and Variety of Vaccinium Species , J. Agric. Food Chem, Vol.46 ; pp.2686-2693
    28. Lee YJ , Lee JH , Kim YH , Kim JH , Yu SY , Kim DB , Lee JS , Cho ML , Cho JH , Kim BK , Lee BY , Lee OH (2015) Assessment of the Pectolinarin Content and the Radical Scavenging-linked Antiobesity Activity of Cirsium setidens Nakai Extracts , Food Sci. Biotechnol, Vol.24 ; pp.2235-2243
    29. Sampson N , Koziel R , Zenzmaier C , Bubendorf L , Plas E , Jansen-Drr P , Berger P (2011) ROS signaling by NOX4 drives fibroblast-to-myofibroblast differentiation in the diseased prostatic stroma , Mol Endocrinol, Vol.25 ; pp.503-515
    30. Basuroy S , Tcheranova D , Bhattacharya S , Leffler CW , Parfenova H (2011) Nox4 NADPH oxidase-derived reactive oxygen species, via endogenous carbon monoxide, promote survival of brain endothelial cells during TNF-α-induced apoptosis , Am J Physiol Cell Physiol, Vol.300 ; pp.256-265