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ISSN : 1229-1153(Print)
ISSN : 2465-9223(Online)
Journal of Food Hygiene and Safety Vol.32 No.4 pp.298-305
DOI : https://doi.org/10.13103/JFHS.2017.32.4.298

Development and Validation of an Analytical Method for Determination of Fungicide Benzovindiflupyr in Agricultural Commodities Using LC-MS/MS

Seung-Hee Lim
, Jung-Ah Do
*, Shin-Min Park
, Won-Min Pak
, Ji Hye Yoon
, Ji Young Kim
1, Moon-Ik Chang
2*
Pesticide and Veterinary Drug Residues Division, National Institute of Food and Drug Safety Evaluation,
Ministry of Food and Drug Safety, Cheongju, Korea
1Import Food Analysis Division, Seoul Regional Food and Drug Administration, Seoul, Korea
2Audit and Inspection Office, Ministry of Food and Drug Safety, Cheongju, Korea
Correspondenceto: Jung-Ah Do, Pesticide and Veterinary Drug Residues Division, Food Safety Evaluation Department, National Institute of Food and Drug Safety Evaluation, Ministry of Food and Drug Safety, Cheongju 28159, Korea 82-43-719-4211, 82-43-719-4200jado@korea.kr
20170425 20170521 20170704

Abstract

Benzovindiflupyr is a new pyrazole carboxamide fungicide that inhibits succinate dehydrogenase of mitochondrial respiratory chain. This study was carried out to develop an analytical method for the determination of benzovindiflupyr residues in agricultural commodities using LC-MS/MS. The benzovindiflupyr residues in samples were extracted by using acetonitrile, partitioned with dichloromethane, and then purified with silica solid phase extraction (SPE) cartridge. Correlation coefficient (r2) of benzovindiflupyr standard solution was 0.99 over the calibration ranges (0.001~0.5 μg/mL). Recovery tests were conducted on 5 representative agricultural commodities (mandarin, green pepper, potato, soybean, and hulled rice) to validate the analytical method. The recoveries ranged from 79.3% to 110.0% and then relative standard deviation (RSD) was less than 9.1%. Also the limit of detection (LOD) and limit of quantification (LOQ) were 0.0005 and 0.005 mg/kg, respectively. The recoveries of interlaboratory validation ranged from 83.4% to 117.3% and the coefficient of variation (CV) was 9.0%. All results were followed with Codex guideline (CAC/GL 40) and Ministry of Food and Safety guideline (MFDS, 2016). The proposed new analytical method proved to be accurate, effective, and sensitive for benzovindiflupyr determination and would be used as an official analytical method.


LC-MS/MS를 이용한 농산물 중 살균제 벤조빈디플루피르의 잔류시험법 개발 및 검증

임 승희
, 도 정아
*, 박 신민
, 박 원민
, 윤 지혜
, 김 지영
1, 장 문익
2*
식품의약품안전처 식품의약품안전평가원 식품위해평가부 잔류물질과
1서울지방식품의약품안전청 수입식품분석과
2식품의약품안전처 감사담당관실

초록


    National Institute of Food and Drug Safety Evaluation
    16161위생안009

    벤조빈디플루피르는 곡류, 두류 등 작물의 녹병(rust) 방 제에 사용되는 pyrazole carboxamide계의 신규 살균제로 2011년 Syngenta사에서 개발하였다1). 작용기작은 미토콘 드리아의 전자전달계에 연계된 구연산회로(citric acid cycle) 에 관여하는 숙실산탈수소효소(succinate dehyderogenase) 를 억제함으로써 녹병균인 Phakopsora pachyrizi (Asian soybean rust fungus)를 저해하는 것으로 알려져 있다2).

    2017년 4월 현재, 벤조빈디플루피르에 대한 식품 중 잔 류허용기준(Maximum Residue Limit, MRL)은 국제식품규 격위원회(Codex Alimentarius Commission, CAC)에서 대 두를 포함한 9종의 식품에 0.01~0.05 mg/kg으로 설정되어 있고, 미국(USA)은 보리 등 23종에 0.01~50.0 mg/kg으로 설정되어 있다3,4). 그 외에 유럽연합(EU)은 포도를 포함한 223종에 불검출 기준인 0.01 mg/kg을 포함하여 최대 0.5 mg/ kg으로, 캐나다(Canada)는 보리 외 147종에 3 mg/kg으로 설정되어 있다5,6). 국내의 경우 2016년 대두, 밀에 대해 각 각 0.07, 0.1 mg/kg이 최초 잔류허용기준으로 고시(2016. 12. 29. 식품의약품안전처 고시 제154호)되었고, 옥수수에 대하여 2017년 잔류허용기준 신설이 예정되어있다.

    벤조빈디플루피르의 잔류물의 정의는 농작물의 잔류시 험연구에서 대사산물이 10% 이상 잔류하지 않는 것으로 확인되었고, 독성학적 중요성이 인정되지 않아 식품의약 품안전처(식약처)에서는 미국, 유럽, 국제식품규격위원회와 동일하게 모화합물로 규정하였다7).

    벤조빈디플루피르의 농산물 중 잔류시험법에 관한 선행 연구는 전 세계적으로 보고된 바가 없다. 그러나 농약이 살포되었을 때 물, 토양 등에 이동되어 잔류될 가능성이 있으므로, 환경매체에 대한 잔류물 분석에 관한 선행 연 구를 조사한 결과, 관련 선행연구가 전무한 실정이었다. 따라서 본 연구에서는 벤조빈디플루피르에 대한 국내 기 준 신설에 따라 물리화학적 특성 및 잔류물의 정의를 고 려한 공정시험법을 개발하고자 하였다. 이에 따라 본 시 험법은 현재 기준 신설 식품인 대두, 밀 및 옥수수 외에 향후 수입되는 식품에 사용이 확대될 가능성을 고려하여 모든 식품에서 분석이 가능하도록 식품공전에서 분류하고 있는 농산물 중 이를 대표할 수 있는 농산물 5종(감귤, 감 자, 고추, 현미, 대두)에 적용하여 시험법을 개발하였다.

    Materials and Methods

    시약 및 재료

    벤조빈디플루피르(99.4%)의 표준품은 Syngenta (Seoul, Korea)사에서 제공받아 사용하였고, 아세토니트릴(acetonitrile), 디클로로메탄(dichloromethane), 헥산(hexane) 등은 HPLC 등급으로 Merck (Darmstadt, Germany)사에서 구입 하여 사용하였다. 염화나트륨은 Wako (Osaka, Japan)사로 부터, 여과보조제 및 무수황산나트륨은 Merck (Darmstadt, Germany)사에서 구입하여 사용하였다. 검체는 식품공전 식물성 원료로 분류 된 대표농산물 5종 감귤(과일류), 감 자(서류), 고추(채소류), 대두(두류), 현미(곡류) 모두 무농약 농산물을 구입하여 균질화한 후 밀봉된 용기에 담아 −50°C 에 보관하고 실험에 사용하였다.

    표준원액 및 표준용액의 조제

    벤조빈디플루피르 표준품 20.12 mg을 20 mL의 아세토 니트릴에 용해하여 1,000 μg/mL의 표준원액을 조제하였다. 이를 시료 무처리 추출물로 희석하여 0.001, 0.005, 0.01, 0.05, 0.1, 0.25 및 0.5 μg/mL의 표준용액을 조제하였다. 표 준원액과 표준용액은 모두 갈색병에 담아 4°C에 보관하여 실험에 사용하였다.

    추출 및 액액분배

    검체를 분쇄하여 균질화한 후 10 g(과일류, 채소류, 서류 는 약 1 kg을 분쇄한 후 10 g, 곡류 및 두류는 약 1 kg을 혼 합하여 표준체 420 μm를 통과하도록 분쇄한 후 10 g)을 정밀히 달아 균질기 용기에 넣고 아세토니트릴 50 mL을 가하여 진탕기에서 10분간 진탕하였다. 여과지가 깔려있 는 부흐너깔때기로 여과보조제 약 10 g을 이용해 흡인여 과한 뒤 아세토니트릴 20 mL로 잔사 및 용기를 씻어내려 앞의 여액과 합친 뒤 이를 40°C 이하 수욕 상에서 감압 농축하였다. 농축 후 잔류물에 증류수 100 mL를 가하여 녹인 후 500 mL 용량의 분액여두에 옮긴 후 포화식염수 20 mL를 더한 뒤 디클로로메탄 50 mL를 차례로 가하고 심하게 흔들어 층이 완전히 분리될 때까지 정치시킨 후 디클로로메탄 층을 무수황산나트륨에 통과시켜 농축플라 스크에 받는 과정을 2회 반복하였다. 이를 40°C 이하의 수 욕 상에서 감압농축 후, 잔류물에 아세톤/헥산 혼합용액 (10/90, v/v) 10 mL를 가하여 최종부피를 10 mL가 되게하 였다. 다만, 지방성 검체(대두, 현미)의 경우 잔류물에 헥 산 30 mL를 잔류물에 가하여 녹인 후 250 mL 분량의 분 액여두에 옮기고 아세토니트릴 30 mL로 2회 분배하여 추 출하였다. 합친 아세토니트릴 층을 40°C에서 감압 농축한 후 잔류물에 아세톤/헥산 혼합용액(10/90, v/v)을 가하여 최종부피를 10 mL가 되게 하였다.

    카트리지 정제

    실리카(Silica) 카트리지에 헥산 10 mL를 2~3 방울/초의 속도로 유출하여 버린 후 고정상 상단이 노출되기 전에 추출액 중 5 mL를 카트리지 상단에 넣고 1~2 방울/초의 속도로 유출시켜 씻어 버렸다. 아세톤/헥산 혼합용액(10/ 90, v/v)을 고정상 상단이 노출되기 전에 10 mL를 유출시 켜 버린 뒤 아세톤/헥산 혼합용액(20/80, v/v) 15 mL를 용 출시켜 받은 시험액을 감압농축플라스크에 취하였다. 이 를 40°C 이하 수욕상에서 감압농축하고 아세토니트릴을 가하여 최종부피 5 mL가 되게 한 뒤 멤브레인 필터(nylon, 0.2 μm)로 여과한 후 시험용액으로 사용하였다.

    LC-MS/MS 분석조건

    농산물 중 벤조빈디플루피르의 분석을 위해 액체크로마 토그래프-질량분석기(Liquid Chromatograph-Tandem Spectrometer, LC-MS/MS)를 사용하였다. 분석용 칼럼은 역상 칼럼으로 C18 칼럼을 선택하였고, 기울기 용리 방식은 0.1% 포름산 함유 아세토니트릴과 0.1% 포름산 수용액을 이동 상으로 사용하였다. 대상성분의 이온화법으로는 electrospray ionization (ESI)법의 positive-ion mode를 사용하였 다. LC-MS/MS의 분석조건은 Table 2와 같다.

    시험법의 검증

    확립된 시험법의 직선성(linearity), 검출한계(limit of detection, LOD), 정량한계(limit of quiantification, LOQ), 회수율(recovery), 재현성(reproducibility)에 대한 유효성을 CODEX 가이드라인(CAC/GL 40, 2003) 및 식약처 식품의 약품안전평가원의 ‘식품등 시험법 마련 표준절차에 관한 가이드라인(2016)을 토대로 검증하였다8,9). 직선성 확인을 위하여 벤조빈디플루피르를 무처리 시료 시험용액으로 희 석하여 조제한 표준 용액 0.005, 0.0025, 0.05, 0.25, 0.5, 1.25 그리고 2.5 ng/μL의 농도범위에 대한 각각의 피크 면 적을 이용하여 검량선(matrix-matched calibration)을 작성 하였고, 검량선의 결정계수(r2)를 구하였다. 또한 검출한계 와 정량한계는 크로마토그램 상에서 신호 대 잡음비(S/N ratio)를 각각 3, 10 이상으로 하였다. 시험법의 정확성 및 재현성을 확인하기 위하여 무처리 시료에 벤조빈디플루피 르의 표준용액을 첨가한 후 분석하여 회수율을 확인하였 다. 회수율 실험의 처리 농도는 LOQ, 10 × LOQ, 50 × LOQ 에 해당하는 농도로 수행하였으며, 각 농산물 검체의 처 리구는 5반복으로 수행하여 평균과 상대표준편차(relative stndard deviation, RSD)를 계산하여 시험법의 정확성, 정 밀성 및 재현성을 평가하였다. 또한, 서울지방식품의약품 안전청 수입식품분석과와 실험실간 검증(inter-lab)을 실시 하여 시험법의 유효성을 확인하였다.

    Result and Discussion

    기기선정 및 분석조건 확립

    벤조빈디플루피르의 화학식은 C18H15Cl2F2N3O로 분자 내 플루오르(F) 2개, 염소(Cl) 2개를 포함하므로, 할로겐 화합 물에 대한 선택적 검출기인 GC-ECD를 사용하여 분석할 수 있다(Fig. 1). 검출기 ECD는 원자 플루오르(F) 3개, 염 소(Cl) 2개 이상일 때, 검출이 가능한 검출기로 벤조빈디 플루피르 분자 내 염소(Cl)를 선택적으로 검출할 수 있고, 증기압이 3.2 × 10−9 Pa (25°C)로 고온에서 GC로 분석이 가 능하다. 그러나 선택적인 검출기와 휘발성이 있는 화합물 임에도 불구하고 분자 내에 존재하는 amide기는 열에 불 안정한 특성으로 열분해가 일어날 수 있어 GC분석의 재 현성이 떨어질 것으로 사료되어 GC분석보다 HPLC 분석 이 더 적합할 것으로 판단하였다. 벤조빈디플루피르는 분 자 내에 이중 결합이 conjugation 되어 있고, 방향족 화합 물인 벤젠고리를 포함하고 있어 UV-Vis 영역에서 흡광도 를 나타내며, 실제 비공유 전자쌍과 이중결합의 전자 전 이에 의해 특정 파장대를 흡수하는 화합물로 확인되었다. 최적 흡광 파장을 확인하기 위하여 파장 210~360 nm에서 스캔한 결과 230 nm를 최적의 흡광 파장으로 확인하였다. 그러나 HPLC-UVD에서 확보한 정량한계는 0.02 mg/kg로 고감도의 정량한계를 확보할 수 없었다. 이에, 시료 중 미 량의 농도를 분석하기 위한 정량한계 확보와 간섭물질에 영향을 받지 않아 선택성이 높은 액체크로마토그래프-질량 분석기(Liquid Chromatograph-Tandem Mass Spectrometry, LC-MS/MS)를 분석기기로 선택하였다8). 분석용 칼럼은 벤 조빈디플루피르의 Log Pow가 4.3으로 비극성인 특성을 고 려하여 극성 물질에서 비극성 물질까지 폭넓게 분리가 가 능한 C18 칼럼을 선택하였고, 0.1% 포름산 함유 아세토니 트릴과 0.1% 포름산 수용액을 이동상으로 사용하는 기울 기 용리 방식으로 분석하였다. 이동상에 사용한 포름산은 protonation enhancer로서 벤조빈디플루피르 분자의 [M+H]+ 이온 생성에 용이하게 작용하였다. 각 대상성분의 이온화 법으로는 electro-spray ionization (ESI)법의 positive-ion mode를 사용하였고 total ion chromatogram (TIC)과 mass spectrum을 통해 selected-ion monitoring (SIM) 분석을 위 한 최적 특성이온을 선정하였다. 평균질량이 398.2 (exact mass: 397.05)인 벤조빈디플루피르 표준용액(0.1 μg/mL)을 일정한 속도(10 μL/min)로 질량검출기에 직접 주입한 결 과 질량이 [M+H]+형태인 398.4 mass 값을 확인하였다. 이 때 cone voltage의 변화에 따른 최적화 과정을 통해 20 V 에서 최대의 peak 강도가 나타남을 확인하였다. 최적화된 cone voltage상태에서 분석의 선택성과 검출강도를 극대화 시키기 위하여 MS/MS 분석 시 MRM (multiple reaction monitoring) mode로 분석하였다. Collision cell에서 collision energy를 조절하여 최적의 precursor/product ion pair를 선 정하였고, 가장 좋은 감도를 보이는 product ion을 정량이 온(quantification ion)으로, 다음으로 크게 검출되는 product ion을 정성이온(qualification ion)으로 설정하여 확인하였다. 최적 기기분석 조건은 Table 1에 나타내었고, 분석조건에 서 선정된 특성 이온과 머무름 시간은 Table 2에 나타내 었다.

    추출 및 분배조건 확립

    벤조빈디플루피르는 산성 및 중성조건에서 지용성으로 존재하고 염기조건에서 수용성으로 존재하며 Log Pow 값 이 4.3인 비극성 화합물이다. 그러나 시료는 수분을 함유 하고 있어 물과 섞이지 않는 비극성 유기용매를 사용할 경우 시료 내부의 침투성이 낮아 충분한 추출이 되지 않 을 것으로 판단되었다. 따라서 수용성 유기용매를 선정하 여 내부 침투를 용이하게 할 수 있도록 추출조건을 확립 하였다. 대표적 수용성 유기용매인 아세톤은 비극성 간섭 물질의 추출률이 비교적 아세토니트릴보다 높은 특성을 갖고, 농산물 시료인 현미, 대두 및 고추 등의 색소인 chlorophyll의 추출률이 높을 것으로 판단되어 다른 수용 성 유기용매인 아세토니트릴을 추출용매로 선정하였다10,11). 추출액은 비극성 벤조빈디플루피르와 극성 간섭물질 분리 를 위해 분배 용매를 선정하여 액-액 분배를 적용하였다. 분배용매 선정은 벤조빈디플루피르의 물리화학적 특성과 용매의 극성지수 및 용해도의 차이를 통해 선정할 수 있 었다. 분배용매로 헥산과 디클로로메탄은 극성지수가 각 각 0.1, 3.1로 비극성이며, 두 용매 모두 분배용매로 가능 할 것으로 생각되었다12). 그러나 용매에 대한 용해도를 살 펴봤을 때, 디클로로메탄(450 g/L)이 헥산(270 g/L)보다 용 해도가 높아 분배효율이 높을 것으로 판단되어 디클로로 메탄을 분배 용매로 선정하였다. 따라서 최종 추출 및 분 배는 아세토니트릴로 추출 후, 시료 추출액의 수분층과 디 클로로메탄층의 명확한 분리를 위해 포화식염수를 첨가하 여 분배효율을 높인 뒤, 디클로로메탄을 이용하여 분배 하 였다. 다만 곡류와 두류 등 유지함량이 높은 검체는 헥산 /아세토니트릴 추가 분배법을 적용하여 유지 등 비극성 불 순물을 제거하였다. 그 결과, 대표농산물 5종에 대하여 90% 이상의 높은 효율을 보였다(Table 3).

    카트리지를 이용한 정제법 확립

    분배 추출액은 이온성을 띄지 않는 벤조빈디플루피르의 손실을 최소화하고, 보다 우수한 정제효과를 얻으며 흡착 제에 대한 친화도의 차이를 이용하는 흡착크로마토그래피 에 의한 정제가 효율적일 것으로 판단되었다11). 흡착제로 는 florisil, silica-gel, alumina, 활성탄 등이 사용되며, 보편 적으로 florisil과 silica-gel이 사용되어진다13,14). Alumina와 활성탄은 흡착력이 매우 강하여 대상물질과 간섭물질을 분리하기에 적합하지 않다고 판단하여 florisil과 silica-gel 을 이용하여 정제조건을 확립하였다.

    벤조빈디플루피르의 극성도(LogPow값 4.3)와 용매의 용 해도를 고려하여 비교적 비극성 용매 조합인 에틸아세테 이트/헥산과 아세톤/헥산 정제효율을 비교하였다. 두 정제 용매조합에서 florisil과 silica 카트리지 모두 회수율이 낮 아 정제용매로 사용할 수 없을 것으로 판단하였으나, 두 카트리지 중 silica가 조금 더 높은 회수율을 보여 silica 카트리지를 우선 적용하였다(Table 4).

    용매 조합을 변경하여 에틸아세테이트/디클로로메탄 혼 합액으로 정제를 한 결과, 97.1%의 높은 회수율을 보였다. 그러나 용출구간을 살펴보았을 때, 에틸아세테이트/디클로 로메탄 혼합액(5/95, v/v) 구획과 에틸아세테이트/디클로로 메탄 혼합액(10/90, v/v)의 구획에서 용출이 되었다. 이는 위의 결과인 에틸아세테이트/헥산 혼합액의 용매조합과 비 교하였을 때, 벤조빈디플루피르는 헥산의 용출강도보다 디 클로로메탄에서 용출강도가 상대적으로 높아 에틸아세테 이트/디클로로메탄 혼합액의 용매조합에서 빠르게 용출 된 것이라 판단하였다. 그리하여 분획을 세분화할 경우 에틸 아세테이트/디클로로메탄 혼합액(5/95, v/v)보다 높은 구획 에서 용출될 가능성이 있어, 카트리지를 씻어버릴 용매 선 택이 어려울 것으로 판단하였다(Table 5).

    따라서, 회수율은 높이며 로딩 후 카트리지를 씻어버릴 용매와 용출시켜 받을 용매의 구획을 명확하게 하기 위해 용매 조합을 변경하기로 하였다. 위의 정제 실험의 혼합 액 에틸아세테이트(4.4)/디클로로메탄(3.9)과 아세톤(5.1)/헥 산(0.1)의 극성지수를 비교하였을 때, 아세톤/헥산의 혼합 액이 비극성인 벤조빈디플루피르와 극성인 간섭물질을 분 리해내기에 더 적절한 것으로 사료되었다. 하지만 벤조빈 디플루피르의 용매에 대한 용해도 측면에서 볼 때, 아세 톤/헥산 혼합액과 에틸아세테이트/디클로로메탄 혼합액의 정제용매를 각각 사용할 때, 분배 추출액을 재용해하는 헥 산(270 g/L)은 디클로로메탄(350 g/L) 보다 용해도가 낮아 분배 추출액에서 벤조빈디플루피르가 재용해가 완벽히 되 지 않았을 것이라 판단하였다. 따라서 분배 추출액의 재 용해 용매를 헥산과, 상대적으로 극성인 용매를 소량 포 함하더라도 용해도를 높일 수 있는 아세톤(350 g/L)을 혼 합하여 재용해 한 뒤 정제 실험을 실시하였다(Table 6). 그 결과, 아세톤/헥산 혼합액(20/80, v/v) 분획에서 98.4%의 높은 회수율을 보여 아세톤/헥산 혼합액을 정제용매로 선 정하였다. 이에 따라 분획을 세분화하고 용출용매를 늘려 세분화 한 결과 아세톤/헥산 혼합액(20/80, v/v) 15 mL에 서 가장 높은 회수율을 보였다(Table 7). 벤조빈디플루피 르의 최종 정제법은 아세톤/헥산 혼합액(10/90, v/v)으로 재용해한 추출액 5 mL를 카트리지에 유출시킨 후 아세톤 /헥산 혼합액(10/90, v/v) 10 mL로 씻어 버리고 아세톤/헥 산 혼합액(20/80, v/v) 15 mL로 용출시켜 받는 방법으로 확립하였다. 이 방법으로 간섭물질을 효과적으로 제거하 고, 분석 대상 물질의 손실은 최소화 할 수 있었다.

    시험법의 검증

    선택성 및 직선성

    벤조빈디플루피르의 선택성(selectivity)은 표준용액, 무처 리 시료, 표준용액을 첨가한 회수율 시료의 크로마토그램 을 서로 비교하였다. 무처리 시료 중 벤조빈디플루피르의 머무름 시간과 질량 대 전하비(m/z)가 같은 간섭물질은 검 출되지 않아 본 시험법은 대상물질을 분석하는 것에 있어 높은 분리능과 선택성을 확보하였다.

    개발된 시험법의 직선성(linearity)을 확인하기 위해 표준 원액을 무처리 추출물로 희석하여 0.001, 0.005, 0.01, 0.05, 0.1, 0.25, 그리고 0.5 μg/mL으로 제조한 후 5 μL를 LCMS/ MS에 주입하여 분석한 결과 모든 농산물 시료 표준 용액에서 결정계수(r2) 0.99 이상으로 높은 직선성을 보여 주었다(Fig. 2).

    검출한계와 정량한계

    벤조빈디플루피르의 검출한계는 기기의 크로마토그램 상 에서 신호 대 잡음비(S/N ratio)를 3이상으로 결정했다. 대 표 농산물 5종에 대한 분석기기의 최소 검출량은 0.0025 ng으로 이에 따른 검출한계는 0.0005 mg/kg이었고, 정량한 계는 신호 대 잡음비(S/N ratio) 10이상으로 계산할 경우 0.005 mg/kg이었다. 검출한계 및 정량한계는 아래에 나타 낸 계산식에 따라 계산되었다.

    검출한계(mg/kg) = 최소검출량(ng)× 1 시료량(g) × 최종희석부피(mL) 시료 주입량 ( μL ) ×희석배수 = 0.0025 ( ng ) × 1 10 ( g ) × 5 ( mL ) 5 ( μL )  × 2 = 0.0005

    *희석배수 =희석부피(mL)/분취량(mL)

    실험실 내 검증

    시험법의 LOQ, 10 × LOQ, 50 × LOQ 농도(0.005, 0.05 및 0.25 mg/kg)로 5회 반복 회수율 실험을 통해 시험법의 정확성, 정밀성 및 재현성을 평가하였다. 실험 결과 평균 회수율은 79.3~110.0%였으며, 상대표준편차가 9.1% 이하 로 확인되었다. 상대표준편차 적합 기준은 CODEX 가이 드라인(CAC/GL 40, 2003)의 처리농도 > 0.001 mg/kg ≤ 0.01 mg/kg일 때 30%, > 0.01 mg/kg, ≤ 0.1 mg/kg의 20%보다 낮 고, 식약처 식품의약품안전평가원의 ‘식품등 시험법 마련 표준절차에 관한 가이드라인(2016)의 처리농도 > 1 μg/kg, ≤ 10 μg/kg일 때, 회수율 범위 60~120%, 변이계수(CV)는 32%, > 10 μg/kg, ≤ 100 μg/kg일 때, 회수율 범위 70~120%, CV값 22%, > 100 μg/kg, ≤ 1000 μg/kg일 때, 회수율 범위 70~120%, CV값 18%로 가이드라인에 부합한 것으로 확 인되었다. 따라서 본 연구는 정확성, 정밀성 및 재현성에 대해 두 가이드라인에 부합하는 것으로 평가되었다(Table 8)8,9). LC-MS/MS를 이용하여 농산물 5종 중 고추와 지방 성 검체 대두에 대한 벤조빈디플루피르의 회수율 크로마 토그램은 Fig. 3에 나타내었다.

    실험실간 검증

    본 연구에서 개발한 시험법은 서울지방식품의약품안전 청 수입식품분석과와 실험실간 검증을 수행하여 시험법의 유효성을 검증하였다. 개발한 시험법을 서울지방식품의약 품안전청에 동일하게 제공하여 분석한 회수율 및 표준편 차를 비교하여 확인한 결과 각 농도에서 회수율은 83.4~ 117.3%, 표준편차는 8.2% 이하였다. 두 실험실간의 평균 회수율은 82.4~109.0%이고, 변이계수(CV %)는 9.0% 이 하로 확인하였다. 따라서, CODEX 가이드라인에서 제시한 실험실간 검증 기준은 처리농도 > 1 μg/kg, ≤ 0.01 mg/kg의 45%, > 0.01 mg/kg, ≤ 0.1 mg/kg의 32%에 만족하고, 식품 의약품안전평가원의 가이드라인(2016)의 처리농도 > 1 μg/ kg, ≤ 10 μg/kg의 46%, > 10 μg/kg, ≤ 100 μg/kg의 34%, > 100 μg/kg, ≤ 1000 μg/kg의 25%에 만족하므로 모든 처리 농도에서 부합한 것을 확인하였다(Table 8)8,9). 따라서 본 연구에서 확립한 시험법은 식품공전에 수록하여 공정시험 법으로 적합할 것으로 판단된다.

    Acknowledgement

    본 연구는 2016년도 식품의약품안전평가원 “2016년 농 약 잔류허용기준 신규 설정 및 개정을 위한 안전관리 근 거 마련 연구(16161위생안009)”의 연구개발비 지원에 의 해 수행되었으며, 이에 감사드립니다.

    Figure

    JFHS-32-298_F1.gif

    Structure of benzovindiflupyr.

    JFHS-32-298_F2.gif

    Matrix-matched calibration curves of corresponding to: benzovindiflupy in mandarin (A), potato (B), green pepper (C), soybean (D) and hulled rice (E).

    JFHS-32-298_F3.gif

    Representative MRM(quantification ion) recovery chromatogram of Benzovindiflupyr corresponding to: green pepper (A), soybean (B), standard solution at 0.05 mg/kg (1), control (2), spiked at 0.005 mg/kg (3), spiked at 0.05 mg/kg (4) and spiked at 0.25 mg/kg (5).

    Table

    Analytical conditions for the determination of benzovindiflupyr

    Selected-ion of LC-MS/MS for benzovindiflupyr

    1)Collision Energy
    2)Quantification ion

    Recovery of dichloromethane for benzovindiflupyr extract effciency

    Comparisons of SPE cartridge for benzovindiflupyr

    Effects of silica cartridge for benzovindiflupyr elution efficiency

    Effects of silica cartridge for benzovindiflupyr elution efficiency

    Comparisons of elution solvent ratio on benzovindiflupyr elution efficiency

    1)Solvent ratio of acetone/n-hexane

    Inter-laboratory validation results of analytical method for benzovindiflupyr residues in samples

    1)Ministry of Food and Drug Safety
    2)Seoul Regional Food and Drug Administration
    3)Recovery average of inter-laboratory
    4)Coefficient of variation of inter-laboratory

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