곰팡이독소는 곰팡이가 생성하는 2차대사산물로 인축에 독성을 나타내고, 열에 안정하여 잘 파괴되지 않으며, 지 금까지 400여종이 보고되어 있다. 이 중 데옥시니발레놀 (deoxynivalenol, DON)과 니발레놀(nivalenol, NIV)은 보리, 밀, 쌀 등에서 붉은곰팡이병균(Fusarium graminearum, F. asiaticum 등)이 작물의 생육기, 특히 개화기에 감염된 이 후 주로 오염된다. 사람이나 동물이 DON이나 NIV에 오염 된 곡물을 섭취할 경우 어지럼증, 구토, 설사, 두통, 열 등 이 발생할 수 있으며 NIV의 독성이 DON 보다 더 강한 것으로 알려져 있다^1,2).

곰팡이독소는 곡물의 겉껍질에 주로 축적되기 때문에 보 리의 경우 쌀보리보다 겉보리에 오염량이 더 많을 수 있 다^3,4). 특히 겉보리는 보리차 또는 엿기름을 만들 때 이용 되며, 이 때 겉껍질을 그대로 이용하기 때문에 비교적 곰 팡이독소 오염에 노출되기 쉽다. 보리는 일반적으로 9월 하순~11월 중순(추파성 품종) 또는 2월 중순~3월 중순(춘 파성 품종)에 파종하여 재배하고, 5월 하순~6월 중순경 비 가오지 않는 날 수확하며, 그 후 수분함량을 14% 이하로 건조하여 저장하였다가 가공 및 포장하여 판매하게 된다⁵⁾. 이때 수확 후 불충분한 건조 및 저장 중 부적절한 온·습 도 관리로 곰팡이와 곰팡이독소의 오염이 증가할 수 있다. 수확 후 보리에서는 Fusarium, Aspergillus, Penicillium, Alternaria속 등의 독소생성 곰팡이들이 주로 발견되며 이 들은 보리에 DON, NIV, 아플라톡신(aflatoxins, AFs), 오 크라톡신 A (ochratoxin A, OTA) 등의 독소를 생성할 수 있다^6,7). 또한 국내산 보리는 중국, 캐나다, 폴란드와는 달 리 DON 보다 독성이 강한 NIV가 더 많이 오염되었다고 알려져 있어^8-10) 보리의 곰팡이독소에 대한 안전관리가 요 구된다. 통계청 자료에 의하면 우리나라의 2015년 보리 생 산량은 조곡 기준으로 85,571톤 이며, 이 중 겉보리는 30,775톤으로 총 보리 생산량의 36%이었다.

수확 후 보리에서 곰팡이와 곰팡이 독소 발생 실태를 보면, 리투아니아에서 2003~2005년 수확기에 수집한 보리 에서 곰팡이 오염실태를 조사한 결과 곡물수분함량이 18% 이상일 때 Aspergillus flavus, Fusarium spp., Bipolaris sorokiniana, Alternaria alternata 등의 독소생성곰팡이가 우점하였으며, 5.5 × 10³~1.6 × 10⁴CFU/g의 곰팡이가 검출 되었다¹¹⁾. 그러나 90°로 4일 동안 열풍 건조하여 수분함 량이 약 15%로 낮아졌을 때 곰팡이의 종류는 건조 전과 유사했으나 개체 수는 2.2~8.2배 감소하였다. 또한 저장 중에는 곡물의 수분활성도(a_w)와 저장온도가 곰팡이의 증 식에 영향을 미친다. Wawrzyniak등¹²⁾에 따르면 보리의 a_w 가 높을수록 곰팡이의 개체수가 시간에 따라 증가하였으 며, 저장온도는 곰팡이의 증가에 큰 영향을 미치지 않았 다. 그러나 F. culmorum과 F. graminearum를 인공 접종한 밀에서는 a_w와 온도가 높을수록 곰팡이가 잘 자라는 경향 을 보였고, 붉은곰팡이는 a_w 0.99, 25°에서 가장 잘 자랐 으며, DON은 a_w 0.98, 25°에서 가장 많이 생성되었다¹³⁾. 또한 다른 연구에 의하면 밀에서 F. graminearum에 의한 DON의 생성이 높은 조건은 a_w≥ 0.97, 30° 이었다^14,15). 실 제 양곡창고에서 곡물의 저장기간에 따른 곰팡이와 독소를 모니터링 한 연구결과 수분함량 19%의 쌀보리 시료에서 저장 20주 후 OTA 24 ppb, citrinin 38 ppb, sterigmatocystin 411 ppb가 검출된 반면, 수분함량 15%의 시료에서는 독소 가 검출되지 않았다¹⁶⁾.

국내에서는 실제 저장창고에서 겉보리의 붉은곰팡이와 독소 오염을 조사한 경우가 아직 보고된 바 없다. 온도와 습도, 수분함량이 조절되는 실험실 조건에서 곡물의 곰팡 이발생과 독소생성 조사 연구는 많으나 실제 곡물 저장 창고에서 곡물의 자연 오염 곰팡이와 곰팡이독소를 모니 터링 한 연구는 매우 드물다.

따라서 본 연구에서는 실제 곡물저장창고에서 저장온도 와 곡물수분함량이 곰팡이와 곰팡이독소 오염에 미치는 영향을 알아보았다. 2015년 수확한 겉보리를 수분함량 14% 와 20%로 조절하여 각각 상온과 저온의 곡물저장창고에서 1년간 저장하면서 저장 중 창고의 온도와 습도를 실시간 으로 측정하고, 그에 따른 겉보리의 수분함량 변화를 1, 3, 6, 12개월 마다 모니터링 하였다. 또한 조사 시기별, 수 집 시료별 붉은곰팡이병균, DON 및 NIV량의 변화를 조 사하여 저장창고의 온도와 곡물수분함량이 저장 중 겉보 리의 붉은곰팡이 및 DON과 NIV 오염량에 미치는 영향 을 밝히고자 하였다.

Materials and Methods

겉보리 수집, 저장 및 온·습도 측정

전라도 지역 3곳에서 2015년에 수확한 겉보리를 1 kg씩 수집하여 실험에 사용하였으며, 각각의 시료이름은 IS1, YG 및 IS2라고 하였다. 수집한 겉보리 시료는 각 600 g을 자연건조 또는 습도 100%에서 1주일간 저장하여 수분함 량을 각각 14%와 20%로 조절하였고 곡물수분측정계(HMM- 700E, Hanyeong System, Seoul, Korea)를 이용하여 시료 의 수분함량을 측정하였다. 시료는 곡물용 포대에 담아 실 제 맥류를 보관하는 상온창고와 저온창고에 각각 저장하 였는데 저온창고는 온도를 12°로 조절하였고 상온창고는 온·습도 조절을 하지 않았다. 각 시료는 2015년 8월 5일 부터 2016년 8월 4일까지 12개월 간 저장하였으며, 저장 초기, 30, 90, 180 및 360일 후 저장중인 시료를 100 g씩 채취하여 분석에 이용하였다. 이 기간 중 온·습도 측정 계(174H, Testo, Lenzkirch, Germany)를 창고 문 옆과 안 쪽에 설치하여 저장기간 동안 창고 내 온도와 습도를 1시 간 간격으로 측정하였다(Fig. 1).

붉은곰팡이병균 오염도 조사

붉은곰팡이가 오염된 낟알의 빈도를 조사하기 위해 시 료별 보리 낟알을 1% 차아염소산나트륨으로 1분간 표면 살균하고, 멸균수로 2번 세척한 후 무작위로 105립을 streptomycin 600 μg/mL이 첨가된 PDA (Potato Dextrose Agar, Difco, Sparks, MD, USA)배지에 치상하였다. 치상 배지는 25°에서 5일간 배양한 후 붉은곰팡이가 자라난 보리 낟알을 계수하였다¹⁷⁾.

붉은곰팡이병균 오염량 조사

겉보리 시료 10 g을 ball mill (MM400, Retsch, Germany) 을 이용하여 15회/초의 진동으로 20초간 분쇄 및 균질화 하고, 그 중 1 g을 막자 사발에서 액체질소와 함께 분쇄하 여 그 중 100 mg을 DNA 추출에 사용하였다. DNA 추출 과 F. graminearum 및 보리의 DNA 검출 프라이머는 Nicolaisen등¹⁸⁾의 방법을 따랐다. DNA 정량은 real-time PCR (CFX96 C1000, BioRad, Hercules, CA, USA)로 증 폭시킨 DNA를 SYBR Green방식으로 검출하였으며, 검량 선은 F. graminearum R3g균주와 겉보리의 DNA를 각각 10, 100, 1000, 10000, 100000 pg/μL 농도에서 증폭시켜 작성하였다. DNA 농도는 분광광도계(Nanodrop 2000c, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)로 측정하였다.

곰팡이독소 분석

겉보리 5 g을 ball mill을 이용하여 30회/초의 진동으로 90초간 분쇄하였고, 증류수 20 mL에 30분간 진탕한 후 여 과지(Whatman No.1, GE Healthcare, Shanghai, China)로 여과하였다. 여과액은 DON, NIV 정제컬럼(DON-NIV^TM WB, Vicam, Watertown, MA, USA)으로 정제하였으며 정 제방법은 Vicam 매뉴얼¹⁹⁾에 따라 실시하였다. 최종 용출 액은 질소가스를 가하여 용매를 완전히 제거한 후 이동상 (물 :아세토니트릴 :메탄올 = 90 : 5 : 5) 1 mL에 녹여 시린지 필터(0.2 μm, Silicycle, Québec, Canada)로 여과하였으며, UHPLC-PDA (Waters Acquity UPLC® H Class, Waters, Singapore)로 분석하였다. 분석 컬럼은 Acquity UPLC® BEH C₁₈, 1.7 μm, 2.1 × 100 mm (Waters, Dublin, Ireland) 를 사용하였으며, 유속 0.3 mL/min, 시료주입량 10 μL, 분 석시간은 10분으로 하여 등용매용리의 방법으로 분석하였 고 UV 검출기의 파장은 218 nm로 설정하였다. 회수율을 구하기 위해 보리에 DON이 오염된 CRM 시료(2.1 mg/kg, TR-D100, Trilogy, Washington, MO, USA) 5 g을 위의 방 법으로 정제 및 분석한 결과, 70% 이상으로 국제기준(EC 401/2006)을 만족하였다.

통계분석

창고 온도와 곡물 수분함량의 2요인(각 요인 별 2 level) 요인설계에 따른 2요인 분산분석(SAS 9.2, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)을 하였으며, 유의수준 p < 0.05에서 유의성을 검정하였다. 또한 창고 간 붉은곰팡이 및 곰팡이 독소 오염의 차이가 있는지 알아보기 위해 t-test를 하고, p < 0.05에서 유의성을 검정하였다.

Results and Discussion

창고의 온·습도와 곡물수분함량의 변화

온·습도 조절이 어려운 상온창고는 외부 기온에 따라 온·습도의 변화가 크게 나타났다(Fig. 1). 저장을 처음 시 작한 8월의 경우 한달 간 상온창고의 평균온도 범위는 21 ~32.1°이었으며 상대습도의 범위는 45~77.3% 이었다. 반 면 저온창고는 8월 온도 11.3~17.5°, 습도는 61.3~97.5% 범위로 상온창고보다 온도는 낮았으나 습도는 높았다. 저 온창고는 온도를 12°로 설정하였으나 창고의 문을 여닫 는 횟수와 외부의 기온 등의 요인에 따라 온도변화가 나 타난 것으로 추정된다. 맥류 생산가이드에 따르면 보리에 서 저장 중 곰팡이와 해충의 오염을 최소화하기 위해 온 도 15° 이하, 습도 65% 이하로 저장할 것을 권장하고 있 다²⁰⁾. 상온창고의 경우 11월에서 이듬해 3월을 제외하고 평균온도가 15° 이상이었고, 평균상대습도는 6~8월인 여 름철을 제외하고 65% 이하였다. 저온창고의 경우 평균온 도는 15° 이하였으나, 1~2월을 제외하고는 평균상대습도 가 65% 이상으로 나타났다.

창고의 온·습도 변화는 곡물의 수분함량에도 영향을 미쳤다. 상온창고에서 초기 수분함량을 14%로 조절한 시 료는 수분함량이 12.6~15.6% 였으나 초기수분함량 20%였 던 시료는 저장기간이 경과할수록 수분함량이 감소하여 12개월 후 14.1% 였다(Fig. 2). 저온창고에서 초기 수분함 량 14% 시료는 저장 1, 3, 6 및 12개월 후 수분함량이 15.1~18.7%였고, 초기수분함량 20%의 시료는 수분함량이 16.3~19.5%였다. 상온창고는 비교적 낮은 상대습도로 인 해 곡물의 수분함량도 낮게 유지되었으며 초기수분함량 14%의 시료는 상대습도가 높은 8월을 제외하고 모두 수 분함량이 14% 이하로 유지되어 곰팡이의 생육에 부적절 한 환경을 나타냈다. 반면 저온창고는 초기수분함량14% 의 시료도 수분함량이 14% 이상으로 높게 유지되었으며, 이는 곰팡이의 생존에 유리한 조건을 형성할 수 있다.

Aw와 수분함량의 관계를 보면, 밀의 경우 Aw 0.85가 수 분함량 17~18%, Aw 0.9가 19~20%, Aw 0.95가 22~24%, Aw 0.98이 25~26%, Aw 0.995가 30% 이었다¹³⁾. 붉은곰팡 이나 곰팡이독소가 잘 생성되는 조건이 Aw 0.97 이상이 므로^12-15), 본 연구에서의 곡물수분함량은 곰팡이나 곰팡이 독소 생성의 최적조건에는 미치지 못함을 알 수 있다.

겉보리 낟알의 붉은곰팡이 오염

상온창고에서 붉은곰팡이가 오염된 낟알수는 시료의 초 기수분함량과 관계없이 대부분의 시료에서 저장기간이 경 과함에 따라 감소하는 추세를 보였다(Fig. 3). 반면 저온 창고에서는 오염빈도가 감소하는 듯 보이나 시료와 저장 기간에 따라 증가 또는 감소하여 일정한 경향을 나타내지 않았다. 특히 상온창고에서 저장 6개월 경과 후 모든 시 료에서 붉은곰팡이의 오염빈도가 3% 이하로 감소하였는 데 이는 작물의 재배 중 감염되는 포장 오염 곰팡이의 생 육조건이 저장 중 환경에 적합하지 않기 때문인 것으로 생각된다. White 등²¹⁾에 의하면 귀리를 1년간 저장하는 중 에 Cladosporium, Rhizopus, Alternaria alternaria 등의 포장 오염 곰팡이들은 저장 기간이 경과하면서 감소하였으나, Penicillium 과 Aspergillus glaucus 등 저장 오염 곰팡이는 개체수가 증가하였다. 밀의 경우 20°C에서 6주간 저장하면 Fusarium 속의 오염율이 22%에서 17%로 감소하였다²²⁾. 또 한 F. graminearum을 접종한 벼, 현미 및 쌀을 21°와 30°에서 120일간 모니터링한 결과, 모든 시료에서 붉은 곰팡이의 개체수가 감소하는 것이 확인되었다²³⁾. Fusarium 속 곰팡이가 생존하기 위한 곡물의 최소수분함량은 17~19% 라고 알려져 있다²⁴⁾. 본 연구에서 상온창고에 저장한 초기 수분함량 20% 시료의 경우 처음 1개월을 제외하고 모든 시료의 곡물의 수분함량이 17% 이하로 붉은곰팡이의 생 존에 부적합한 것을 알 수 있다. 반면 저온창고에 저장한 초기수분함량 20%인 시료는 저장 6개월차를 제외하고 수 분함량이 모두 17% 이상이었으며, 초기수분함량 14% 시 료도 비교적 수분함량이 높게 유지되어(Fig. 2) 붉은곰팡 이의 생존에 유리한 조건을 형성한 것으로 보인다. 따라 서 이 결과는 수분함량이 곡물의 저장 중 곰팡이의 생장 에 중요한 영향을 미치는 사실을 뒷받침해준다^13,23).

붉은곰팡이의 오염량을 DNA 수준에서 정량 분석한 결 과 상온창고에서 저장 6개월까지 초기수분함량 20%인 시 료의 붉은곰팡이의 오염량이 14%보다 많았으나(t-test, p < 0.05) 이를 제외하곤 뚜렷한 경향을 나타내지 않았다 (Fig. 4).

곰팡이독소 오염량

겉보리의 곰팡이독소 분석 결과 NIV의 농도가 DON보 다 높았으며, DON의 경우 오염량이 1 ppm 미만으로 적 거나 정량한계 미만이었다(Fig. 5). 이는 우리나라에서 보 리에 DON보다 NIV의 오염이 더 많다는 보고^8-10)와 일치 하는 결과이다. 창고 별 시료의 초기 수분함량에 따른 차 이를 살펴보면, IS1시료의 경우 상온과 저온창고 모두에 서 초기수분함량 20% 시료의 NIV 오염 수준이 14%보다 대부분 많았으나 YG와 IS2 시료에서는 오염량의 차이가 미미하거나 저장기간에 따라 다른 양상을 보였다(t-test, p < 0.05). 시료의 초기 수분함량 별 저장창고에 따른 NIV 오염량의 차이를 보면 초기수분함량 14%와 20% 모두 저 장 12개월 후 상온창고에 보관한 시료에서 NIV의 오염이 많은 경향을 보였으나 저장 1, 3 및 6개월 후에는 서로 다 른 양상을 보이거나 곰팡이독소량의 차이가 뚜렷하지 않 았다(t-test, p < 0.05).

한편 동일 시료에서 저장기간의 경과에 따라 검출되는 곰팡이독소량이 감소한 것은 대표성 있는 시료를 채취하 지 못했기 때문일 수 있다. 곰팡이독소의 경우 오염이 시 료 전반에 고르게 발생하지 않고 특정부분에 집중적으로 발생하며²⁵⁾, 분석에 필요한 시료의 양은 매우 적어 대표성 있는 시료를 얻기가 쉽지 않다. ISO (ISO 13690)나 EU (EC 401/2006)등 국제기구에서는 곰팡이독소 분석대상 원 료의 종류와 양 등에 따라 효과적인 시료 채취법을 제시하 고 있으며, 시료의 양이 많을 경우 여러 지점에서 시료를 반복적으로 채취할 것을 요하고 있다. 본 연구에서는 총 600 g의 시료를 저장하고 시료수집 시기 별 100 g씩 채취 하여 분석에 이용하였다. 이에 시료의 총량이 일반적으로 저장하는 양인 1000 kg에 비해 매우 적었고 시료채취 시 기마다 시료의 총량이 1/6으로 감소하여 실제 환경과 달 랐으며, 여러 개의 시료를 동일한 방법으로 채취하지 못 한 것이 실험결과에 영향을 주었을 수 있다.

창고온도와 초기 곡물 수분함량의 상호작용

창고 온도와 수분함량의 2요인 분산분석 결과, 겉보리 낟알의 붉은곰팡이의 오염빈도는 저장 3, 6 및 12개월 후 저장온도의 영향을 받는 경우가 많았으며, NIV함량은 저 장온도와 수분함량간 상호작용의 영향을 받는 경우가 많 았다. 반면 DON은 오염량이 적어 요인의 영향을 알기 어 려웠다(Table 1). Ramirez 등¹⁴⁾은 밀에서 F. graminearum 의 생장과 DON의 생성량을 분석했을때, F. graminearum 의 생장에 a_w와 온도의 상호작용의 영향이 있다고 보고하 였다. 또한 Hope 등¹³⁾은 F. culmorum과 F. graminearum을 인공 접종한 밀에서 DON의 생성량에 a_w와 온도의 상호작 용의 영향이 있음을 보고하였다. 본 연구결과 겉보리 낟 알의 붉은곰팡이 오염도는 저장온도의 영향이 비교적 많 았고, 실제로도 창고 간 붉은곰팡이 오염립의 갯수가 시 간이 경과함에 따라 차이가 있음을 알 수 있었다(Fig. 3). NIV의 경우 저장 1, 3 및 6개월 후 저장온도 ×초기 수분 함량이 p-value 0.05 이하로 나타나는 빈도가 많아 상호작 용의 영향을 알 수 있었고, 저장 12개월 후엔 저장온도와 수분함량 각각의 영향을 받는 빈도가 더 많아 저장기간이 길수록 상호작용이 줄어듦을 알 수 있었다.

이와 같이 실제 저장 환경에서는 창고의 온·습도, 곡 물의 수분함량이 끊임없이 변화하고 본 연구에서 조사한 두 요인 외에 다른 요인도 영향을 미칠 수 있기 때문에 이 에 따른 곰팡이나 독소의 오염 양상을 해석하고 예측하는 것이 쉽지 않다. 위의 결과를 종합해보면, 건조가 덜 된 겉보리의 경우 저온창고에 보관하는 것이 붉은곰팡이의 오염을 줄일 수 있으나 곰팡이독소의 오염량을 줄이는 데 는 한계가 있을 수 있으며, 건조한 겉보리의 경우, 상온이 나 저온창고 어느 곳에 보관하더라도 붉은곰팡이나 곰팡 이독소 오염량에 큰 차이가 없었으나 12개월 이상 장기보 관 시에는 저온창고에서 보관해야 곰팡이독소의 오염량을 줄일 수 있다는 결론을 내릴 수 있다. 따라서 겉보리를 저 장할 때 온도나 수분함량을 곰팡이 생육에 불리하도록 조 절하는 것이 곰팡이독소 오염 예방에 가장 중요하며, 이 를 위해 특히 여름철에는 붉은곰팡이의 생존과 곰팡이독 소 생성에 적합한 온도인 25~30°C가 되지 않도록 주의하 고, 수확 후 곡물을 14% 이하로 건조하여도 저장 환경에 따라 곡물수분함량이 증가할 수 있으므로 창고의 습도관 리에 유의해야 할 것이다. 또한 저온창고의 경우, 습도가 높아 전력공급 중단 등으로 온도가 상승하면 곰팡이가 급 증할 수 있으므로 온도관리를 철저히 하고, 겨울철인 12 월~2월에는 상온창고와 저온창고 모두 온도가 12° 이하 이나 습도는 오히려 상온창고가 더 낮아 붉은곰팡이의 생 존에 불리한 환경이므로, 저온창고의 가동을 중단하여 전 기를 절약하는 것이 더욱 효율적일 수 있다.