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ISSN : 1229-1153(Print)
ISSN : 2465-9223(Online)
Journal of Food Hygiene and Safety Vol.32 No.6 pp.542-549
DOI : https://doi.org/10.13103/JFHS.2017.32.6.542

Evaluation of the Bacteriological and Toxicological Safety for the Shellfish Growing Area in the Kamakman Area, Korea

Kwang-Soo Ha*, Soon-Bum Shin1, Ka-Jeong Lee2, Sang-Hyeon Jeong1, Eun-Gyoung Oh1, Hee-Jung Lee, Dong-Wook Kim, Yeon-Kye Kim
Food Safety and Processing Research Division, National Institute Fisheries Science, Busan, Korea
1South Sea Fisheries Research Institute, National Institute Fisheries Science, Yeosu, Korea
2Southeast Sea Fisheries Research Institute, National Institute Fisheries Science, Tongyeong, Korea
Correspondence to: Kwang-Soo Ha, Food Safety and Processing Research Division, National Institute Fisheries Science, Busan, 46083, Korea 82-51-720-2642,82-51-720-2619ksha@korea.kr
20170918 20171005 20171012

Abstract

To evaluate bacteriological and toxicological safety, the hygienic indicator bacterium and paralytic and diarrhetic shellfish toxins in the shellfish produced in the Kamakman Area from 2012 to 2016 were investigated. Fecal coliforms and E. coli of all 194 oyster samples tested did not exceed 230 MPN/100 g. The geometric mean of the fecal coliform analyzed with the oyster samples of harvesting period was 19.6 MPN/100 g, which was more stable than the non-harvesting period (26.5 MPN/100 g). For the toxicological evaluation of the Kamakman Area, 77 oyster samples and 350 mussel samples as an indicator were analyzed. Paralytic shellfish toxins were detected very low in the range of 40~46 μg/100 g in 13 mussel samples during late April and early June, but not in oyster samples. Diarrhetic shellfish toxin was detected in 2 of 180 samples, but it was found to be below the regulation value (0.16 mg OA equ./kg). Based on the bacteriological studies, it was confirmed that the shellfish produced in Kamakman area meets the standard of shellfish hygiene of the Food Sanitation Act and meets the Grade A of the shellfish production area of EU. As the results of the paralytic and diarrhetic shellfish toxin evaluation, it was confirmed that the Kamakman Area is also toxicologically safe for shellfish production.


가막만해역 패류의 세균학적·독물학적 안전성 평가

하광수*, 신순범1, 이가정2, 정상현1, 오은경1, 이희정, 김동욱, 김연계
국립수산과학원 식품위생가공과
1남해수산연구소 양식산업과
2남동해수산연구소

초록


    National Fisheries Research and Development Institute
    R2017057

    가막만해역은 전라남도 여수시의 도심, 화양면, 화정면 및 돌산읍으로 둘러싸여 있는 타원형의 반폐쇄성 내만으 로 육상으로부터 영양염의 유입과 먹이생물의 번식이 원 활하여, 전남 지역의 대표적인 패류생산해역으로 알려져 있다1).

    패류는 주로 해안과 인접한 지역에서 서식하므로, 도심 주거지역, 가축 사육지, 야생동물 서식지, 선박계류장 등 에서 발생하는 분변에 오염되기 쉽고2-3), 여과섭이 활동을 통해 영양을 섭취함으로 체내에 축척된 세균, 바이러스, 및 패류독소 등의 병원소로 작용하며, 각종 질병의 매개 체로 인식되어 왔다4-5). 패류는 오염물질을 쉽게 축적 할 뿐만 아니라 패각을 제외한 장기관 및 연체부 전체를 가 식부로 이용한다는 점에서 패류의 안전한 섭취를 위해서 는 서식하고 있는 해역에 대한 위생적인 관리가 매우 중 요하다6). 따라서 패류의 위생안전성 확보를 위하여 패류 생산해역의 위생관리는 대단히 중요하며, 미국, 유럽연합 등 선진국에서는 패류생산해역의 위생상태에 따라 등급을 부여하여 관리하고 있다.

    패류생산해역의 관리등급은 해수와 패류의 위생지표세 균을 근거로 결정된다. 미국은 해수의 분변계대장균 함량 으로 패류생산해역을 허가해역, 조건부 허가해역, 제한해 역, 조건부 제한해역, 금지해역으로 분류하며, EU는 패류 의 대장균 함량을 분석하여 A, B, C 등급으로 나누어 해 역을 관리하고 있다. 그리고 뉴질랜드와 일본은 해수 및 패류의 위생 상태에 따라 해역등급을 결정하여 관리하고 있다7-8).

    인체에 급성치사 독성을 나타내는 마비성패류독소는 패 류생산해역의 위생안전성 확보를 위해반드시 관리되어야 하는 항목이다. 마비성패류독소에 의한 최초의 중독사고 는 1790년 러시아의 알래스카 탐험대가 담치를 섭취하고 100여명이 사망한 사건이 기록된 후로, 최근에는 전 세계 적으로 발생되고 있는 것으로 보고되고 있다9). 설사성패 류독소는 1960년대 네덜란드에서 최초의 식중독 보고가 있었다. 그 후 일본, 스페인, 프랑스, 스웨덴 등의 유럽지 역에서 수 만건이 넘는 중독사고가 보고되고 있다10). 이처 럼 패류생산해역에 대한 안전성 평가를 위해서는 패류 섭 취로 인한 식중독 발생의 주요 원인이 되고 있는 독물학 적 안전성이 반드시 확보되어야 한다.

    지금까지 가막만해역의 위생학적 안전성을 평가한 연구 는 해수에 대한 수질평가와 강우 후 해수 및 굴의 세균학 적 변화에 대한 연구뿐이며, 생산되고 있는 패류를 직접 분 석하여 해역의 위생학적 안전성을 평가한 연구는 없었다11-12).

    본 연구는 2012년부터 2016년까지 가막만해역에서 주로 생산되는 패류인 굴의 위생지표세균 분석을 통하여, 동 해 역이 패류 생산해역으로 적합한 위생상태인지 평가하였다. 또한 패류의 마비성패류독 및 설사성패류독 함량을 분석 하여 독물학적 안전성이 유지되고 있는지 확인하였다.

    Materials and Methods

    조사지점 및 기간 선정

    가막만해역은 수출용 패류생산해역으로 지정되어 관리 되고 있다. 지정해역 경계선 내부에 위치한 해역에서는 굴 (Crassostrea gigas)이 생산되고 있으며, 여수시 도심이 위 치한 북부해역에는 주로 지중해담치(Mytilus galloprovincialis) 양식이 활발하다. 2012년부터 2016년까지 가막만해역에 대한 세균학적 안전성평가를 위하여 가막도(O-3), 평사리 (O-4), 안포리(O-5), 세포리(O-6), 금봉리(O-7)에 굴 조사지 점 5개소를 선정하여 조사하였다. 또한 독물학적 안전성 평가를 위해 굴 조사지점 2개소(O-6, O-7) 뿐만 아니라 경 호동(M-1), 소호동(M-2) 및 평사리(M-4), 금봉리(M-5)에 마비성패류독의 지표종인 지중해담치 조사지점 4개소에 대한 패류독소 분석을 실시하였으며, 조사지점의 위치를 Fig. 1에 나타내었다.

    위생지표세균 분석

    시료 중 분변계대장균, 일반세균수 분석은 Recommended Procedures for the Examination of Seawater and Shellfish 의 방법13)에 따라 시험하였다. 분변계대장균은 최확수법 (Most Probable Number, MPN)으로 시험하였으며, 결과는 100 g 당 MPN으로 나타내었고, 세균수는 g당 Colony Forming Unit (CFU)로 나타내었다. 패류의 대장균 분석은 ISO/TS 16649-3의 방법14)에 따라 분석하였다.

    마비성패류독소 분석

    가막만해역에서 생산된 굴 및 지중해담치의 마비성패류 독(Paralytic Shellfish Poisoning, PSP) 함량을 측정하기 위 하여 APHA 방법에 준하여 분석하였다13). 패각의 외부 및 내부의 이물질을 수도수로 세척한 후, 물기를 제거한 패 류육을 균질화하고, 시료 100 g에 0.1 N HCl 동량을 첨가 하였다. 시료의 pH 2.0~4.0 범위가 되도록 조정하여 100°C 에서 5분간 가열한 후, 냉각하고 다시 pH를 조정하여 200 mL로 정량하였다. 원심분리한 상등액을 시료로 하여 mouse의 복강에 1 mL씩 주입하고 사망시간을 확인하여 sommer’s Table에 따라 독력을 계산하였다.

    설사성패류독소 분석

    설사성패류독소(Diarrhetic Shellfish Poisoning, DSP) 분 석에 사용된 okadaic acid (OA), dinophysistoxin-1 (DTX- 1), dinophysistoxin-2 (DTX-2) 표준품은 Canada의 National Research Council (NRC, Halifax, Canada)에서 구입하였고, 탈각한 시료는 90% MeOH로 추출하여 원심분리 후, 0.22 μm syringe filter로 여과하여 분석하였다. Acetonitrile과 methanol 등 용매는 Merck (Darmstadt, Germany)의 HPLC grade를 사용하였고, formic acid, ammonium formate, 등 은 Sigma (St. Louis, MO, USA)의 mass spectormetry grade를 사용하였다. 이동상은 formic acid와 ammonium formate가 각각 50 mM 및 2 mM이 되도록 만든 수용액 A 용액과 동일 농도의 formic acid와 ammonium formate가 함유된 95% acetonitrile B용액을 사용하였다. 두 용액의 비율을 80:20으로 시작하여 1.5분에 걸쳐 B 용액을 20% 에서 80%까지 올린 후, 3.5분간 유지하여 독성분을 용출한 후, 다시 20%로 낮추어 1.5분간 column의 평형화 시간을 갖도록 하였고, 유속은 250 μL/min의 조건으로 하였다.

    설사성패류독소 분리를 위해 ACQUITY UPLC H-Class (Waters, Milford, MA, USA)를 사용하였고, mass spectrometer는 Xevo TQ-S (Waters, Milford, MA, USA)를 사용 하였다. 분석용 column은 ACQUITY UPLC® BEH C18 (2.1 × 100 mm, 1.7 μm)를 사용하였으며, mass의 분석조건 은 capillary voltage는 3.5 kV, cone voltage는 40 V, source temp는 150°C, desolvation temp는 350°C로 분석하였다. 시 료검출은 MRM (Multiple reaction monitoring) 법으로 하 였으며, 각 성분분석을 위한 기기의 parameter는 Table 1에 나타내었다.

    Results and Discussion

    세균학적 안전성평가

    가막만해역 내에 위치한 굴 조사지점 5개소(O-3~O-7)에 서 분석한 분변계대장균, 대장균 및 세균수의 검출범위, 기하평균치, 90th percentile 값 등을 Table 2에 나타내었다. 2012년 1월부터 2016년 12월까지 매월 1회씩 패류에 대 한 조사를 실시하였으나, 굴 수확을 마친 어장에서는 시 료를 채취할 수 없어 총 42회, 194점의 굴 시료에서 세균 함량을 분석하였다. 검출된 분변계대장균 및 대장균 수의 범위는 각각 < 18~230 및 < 18~220 MPN/100 g 이었다. 대장균수의 기하학적평균치의 범위는 20.1~25.1 MPN/100 g 로 낮게 나타났다.

    식품공전15)의 생식용 굴에 대한 기준규격은 대장균 230 MPN/100 g을 초과하지 않도록 설정되어 있다. 따라서 가 막만해역에서 2012년부터 2016년까지 생산된 굴은 국내 식품위생법의 기준을 만족하는 것으로 확인되었다. 또한 유럽연합의 해역평가 기준인 Commission Regulation (EU) 2015/22857)에 따르면 생산된 패류를 즉시 생식할 수 있는 A 등급해역은 조사기간 동안 80%의 시료가 230 E. coli MPN/100 g을 초과하지 않아야 하며, 초과한 20%의 시료 중에서 700 E. coli MPN/100 g을 넘는 시료가 없어야 한 다. 따라서 유럽연합의 기준에 따른 평가에서도 가막만해 역은 A 등급의 패류생산해역으로 분류되었다. 미국은 해 수의 위생상태를 평가하여 패류생산해역을 허가해역, 조 건부 허가해역, 금지해역 등으로 분류하며, Kwon 등11)도 1998년부터 2008년까지 가막만해역 해수에 대한 세균학적 평가를 수행하였으며, 가막만해역이 미국의 허가해역 수 질기준에 적합함을 확인하였다.

    또한 식품공전에서 소비자가 그대로 섭취할 수 있도록 유통판매를 목적으로 위생처리하여 용기 포장에 넣은 동 물성 냉동수산물의 경우, 세균수 기준을 100,000 CFU/g으 로 설정하고 있다. 가막만해역에서 생산된 굴의 세균수는 3,600 CFU/g 이하로 매우 안전한 수준이었다.

    경남지역에 위치한 한산·거제만해역과 자란만·사량도 해역의 육상오염원의 영향 및 굴에 대한 위생학적 안전성 을 평가한 Mok16-17)의 연구결과에서도 분변계대장균 및 대 장균의 검출범위가 230 MPN/100 g을 초과하지 않는 것으 로 나타났다. 또한 분변계대장균의 기하학적평균치는 각각 23.7~26.7 및 19.3~25.0 MPN/100 g으로 가막만해역(20.1~ 25.1 MPN/100 g)과 비슷한 수준이었다. 경남과 전남해역 에 위치한 대표적인 굴 생산해역의 위생학적 안정성은 국 내 및 외국의 기준에 부합한 것으로 확인되었다.

    수확시기에 따른 위생학적 성상

    굴 수확시기는 일반적으로 10월부터 다음해 5월까지 지 속되며, 비수확기는 6월부터 9월까지의 하절기를 포함한 다. 수확시기에 따른 굴의 위생상태를 비교한 결과를 Table 3에 나타내었다. 수확기 및 비수확기에 검출된 분변계대 장균의 범위는 각각 < 18~130 및 < 18~230 MPN/100 g으 로 비수확기의 분변계대장균수가 더 높게 검출되었고, 기 하학적평균치도 19.6 및 26.5 MPN/100 g로 다소 높았다. 대장균과 세균수 검출결과도 비수확기의 오염정도가 높게 나타났다. 이러한 이유는 패류생산해역의 해수에 대한 위 생학적 평가연구18-19)에서 비수확시기가 우리나라 하절기를 포함하고 있으며, 강우의 빈도가 높고, 강우량이 증가함에 따라 자란만·사량도해역과 창선해역에서 각각 염분이 낮 게 나타나고, 육상의 오염물질 유입이 증가하면서 패류의 위생상태가 악화되는 것으로 보고하고 있다. 자란만·사 량도해역의 경우 월별 염분농도가 26.62~34.65 psu 범위였 으며, 대량 강우가 발생한 7월에 26.62 psu로 가장 낮게 나타났고, 육상 인근에 위치한 시료뿐만 아니라 해역 중 앙에서 채취한 해수시료에서도 분변계대장균의 함량이 높 게 검출되었다. 창선해역 해수의 월별 염분농도는 30.22~ 33.70 psu 범위였으며, 장마와 태풍 등 강우량이 많은 7~10 월에 낮은 염분을 나타내었고, 해수의 분변계대장균이 43 MPN/100 mL을 초과한 시료는 9월에 17개 시료로 가장 많았다.

    강우가 패류의 세균학적 수질에 미치는 영향

    강우량과 강우 후 경과시간이 패류생산해역의 세균학적 수질변화에 미치는 영향을 파악하기 위하여, 조사 3일전 부터 조사 당일까지 강우가 있었던 경우를 대상으로 강우 가 해역에 미치는 수질변화를 Table 4에 나타내었다. 조사 기간 동안 해역에 미치는 영향이 적을 것으로 판단되는 10 mm 이하의 강우가 있거나, 두 지점 이상에서 분변계 대장균 및 대장균이 검출되지 않은 경우에는 패류의 위생 학적 안전성에 영향을 미치지 않는 것으로 판단하여 분석 에서 제외하였다. 강우영향에 대한 평가결과, 조사 3일전 부터 12.3, 37.0 및 58.6 mm의 강우가 내린 후 실시한 세 번의 조사에서 분변계대장균군, 대장균 및 세균수는 모두 유의적인 차이를 나타내지 않았다. 하지만 2016년 9월 184.2 mm의 강우 후에 실시한 조사에서는 전체 지점에서 대장균이 검출되었고, 범위는 45~170 MPN/100 g으로 높 게 나타나, 조사 이틀 전에 내린 180.9 mm의 강우로 인한 육상의 오염물질이 해수를 통해 패류의 체내에 농축되어 위생상태에 영향을 미친 것으로 판단된다. Park12)은 강우 가 가막만해역 해수의 세균학적 수질에 큰 영향을 미치며 강우 후 24~48시간 경과 후, 평소의 수질로 회복되어 간 다고 보고하였다. 또한 Yoo19)는 창선해역의 경우, 조사 4 일전부터 2일전까지 47.5 mm의 강우 후에 해수는 조류 소 통으로 외해수와의 교환을 통해 빠른 시간에 수질을 회복 하였지만, 체내에 세균을 축적한 패류는 대장균 값이 490 MPN/100 g으로 나타나 해수보다는 강우영향이 오래 지속 됨을 보고하였다.

    강진만해역에 대한 패류의 위생학적 성상에 대한 연구20) 에서 피조개 총 54개 시료 중 2007년 9월과 2009년 7월 에 발생한 강우의 영향으로 2개 시료에서 분변계대장균의 기준치를 초과하였다고 보고하였다. 또한 창선해역의 지 중해담치에 대한 위생학적 평가19)에서도 2007년 9월 및 2008년 8월의 강우영향으로 인해 대장균 기준치를 초과한 것으로 보고하였다. 이처럼 패류생산해역의 위생학적 안 전성에 가장 큰 영향을 미치는 요소는 강우로 판단된다. 우리나라에서 패류수출을 목적으로 외국의 위생기준에 맞 추어 해역을 관리하고 있는 수출용 패류생산 지정해역의 경우, 해역별 강우량에 따른 패류채취 금지일을 설정하여 운영하고 있다. 국내 유통을 목적으로 패류를 생산하고 있 는 해역도 강우에 대한 영향을 평가하여, 패류채취 금지기 간을 설정하고 관리할 수 있는 기초 연구가 확대되어야 한다.

    독물학적 안전성 평가

    2012년부터 2016년까지 가막만해역 굴 조사지점(O-6, O- 7) 및 지중해담치 조사지점(M-1, M-2, M-4, M-5)에서 각 각 77점 및 350점의 패류시료에 대한 마비성패류독소 검 출결과를 요약하여 Table 5에 나타내었다. 총 427개 시료 중 13개 시료에서 식품위생법에서 설정하고 있는 마비성패 류독소 기준치인 80 μg/100 g 미만의 소량이 검출되었다. 마비성패류독소는 지중해담치에서 4월말에서 6월초 사이 에 검출되었으며 40~46 μg/100 g 범위로 낮게 나타났다. 굴에서는 마비성패류독소는 검출되지 않았으며, 주로 10 월에서 다음해 3월경에 채취를 완료하므로 패류독소 검출 시기에 분석된 시료수가 충분하지는 않았다. 하지만 Mok9) 은 수산생물 종류별 마비성 패류독소 축적에 관한 연구에 서 패류독소 발생해역에 시험생물을 시설하여 동일한 시 기에 분석한 결과, 지중해담치(159 μg/100 g)와 가리비(95 μg/100 g)는 패류독소 기준치를 초과하였으나, 바지락(71 μg/100 g)과 굴(58 μg/100 g)은 기준치 이하 검출되어 지중 해담치가 패류생산해역의 마비성패류독소 안전성 확인을 위한 지표종으로 유용하다는 사실을 확인하였다.

    설사성패류독소는 굴 1개 지점(O-7) 및 지중해담치 2개 지점(M-1, M-5)에서 총 180점에 대한 OA, DTX-1, DTX- 2 독소함량을 분석하였다. 각 독소성분의 결정계수(r2)는 0.99 이상으로 높은 직선성을 나타내었으며, 각 성분은 OA (3.4 min), DTX-1 (4.0 min), DTX-2 (3.5 min)에 검출되었 다(Fig. 2 & 3). LC-MS-MS로 분석한 설사성패류독소 각 성분의 정량한계는 10 μg/kg으로 확인되었으며, 2016년 6 월 가막만 경호동(M-1) 및 금봉리(O-5)에서 각각 19 및 22 μg/kg의 okadaic acid가 검출되었다. 또한 경호동 시료 에서는 DTX-1도 2 μg/kg으로 정량한계 이하로 매우 낮게 나타났다. 하지만 우리나라 식품위생법에서 설정한 설사 성패류독소 기준치인 OA와 DTX-1 합이 160 μg/kg 이하 에 미치지 않는 소량이었다. 그리고 DTX-2는 모든 시료 에서 검출되지 않았다. 이상의 결과, 가막만해역에서 생산 되는 굴은 세균학적, 독물학적으로 우리나라와 EU 등의 패류생산해역 기준에도 적합한 위생상태를 유지하고 있음 을 확인하였다.

    Acknowledgement

    이 논문은 국립수산과학원의 수산과학연구사업 중 수 출패류 생산해역 및 수산물 위생조사 R2017057)의 지 원으로 수행된 연구결과입니다.

    Figure

    JFHS-32-542_F1.gif

    Sampling stations in the Kamakman area. ●, Oyster; ■, Oyster and Mussel; ○, Mussel.

    JFHS-32-542_F2.gif

    The standard curve for okadaic acid (OA), dinophysistoxin-1 (DTX1) and dinophysistoxin-2 (DTX2).

    JFHS-32-542_F3.gif

    Chromatograms of the standard solution (100 μg/kg) of okadaic acid (OA), dinophysistoxin-1 (DTX1) and dinophysistoxin- 2 (DTX2).

    Table

    LC-MS/MS parameters for detection of diarrhetic shellfish poisoning toxins

    1)Electrospray negative ion

    Results of the bacteriological examinations of oyster in Kamakman from 2012 to 2016

    1)Geometric Mean.
    2)The estimated 90th percentile.

    Results of the bacteriological examinations of oyster during harvesting and non-harvest season in Kamakman from 2012 to 2016

    1)Geometric Mean.
    2)The estimated 90th percentile.

    Effect of rainfall and time on the bacteriological quality of oyster in Kamakman from 2012 to 2016

    Results of mouse bioassay for PSP in shellfish in Kamakman region from 2012 to 2016

    1)Not detected or all three mice were not dead within 1hrs, after injection of 0.1 N HCl extract.
    2)Sample shellfish were not available to collect.

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