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ISSN : 1229-1153(Print)
ISSN : 2465-9223(Online)
Journal of Food Hygiene and Safety Vol.32 No.6 pp.507-512
DOI : https://doi.org/10.13103/JFHS.2017.32.6.507

Evaluation of Efficacy and Development of Predictive Reduction Models for Escherichia coli and Staphylococcus aureus on Food Contact Surfaces as a Function of Concentration and Contact Time of Chlorine Dioxide

So-Jeong Yoon, Shin Young Park, Yong-Soo Kim1, Sang-Do Ha*
Advanced Food Safety Research group, BrainKorea21 Plus, Department of Food Science and Technology, Chung-Ang University, 4726, Seodong-daero, Nae-ri, Daedeok-myeon, Anseong-si, Korea
1Korea Health Industry Development Institute, Osong, Korea
Correspondence to: Sang-Do Ha, Department of Food Science and Technology, Chung-Ang University, 4726, Seodong-daero, Nae-ri, Daedeok-myeon, Anseong-si, Gyeonggi-do 17546, Korea 82-31-670-4831,82-31-675-4853sangdoha@cau.ac.kr
20170718 20170820 20171017

Abstract

There has been increasing concern regarding misuse of disinfectants and sanitizers such as ethanol, sodium hypochlorite, and hydrogen peroxide for food contact surfaces in the food industry. Examining the efficacy of the concentration of currently used disinfectants and sanitizers is urgently required in the Korean society. This study aimed to develop predictive reduction models for Escherichia coli and Staphylococcus aureus in suspension, as a function of ClO2 (chlorine dioxide) and contact time using response surface methodology. E. coli ATCC 10536 and S. aureus ATCC 6538 (initial inoculum, 8-9 log CFU/mL) in tryptic soy broth were treated with different concentrations of ClO2 (5, 20, and 35 ppm) for different contact times (1, 3, and 5 min) following a central composite design. The polynomial reduction models for ClO2 on E. coli and S. aureus were developed under the clean condition. E. coli reduction by 35 ppm ClO2 for 1, 3, and 5 min was 2.49, 2.70, and 3.65 logCFU/mL, respectively. Also, S. aureus reduction by 35 ppm ClO2 for 1, 3, and 5 min was 4.59, 5.25, and 5.81 logCFU/mL, respectively. The predictive response polynomial models developed were R = 0.43231 − 0.056492*X1 − 0.097771*X2 + 9.24167E − 003*X1*X2 + 3.06333E − 003*X12 (R2 = 0.98) on E. coli and R = 1.10542 − 0.20896*X1 − 0.046062*X2 + 8.30000E − 003*X1*X2 + 8.73300E − 003*X12 (R2 = 0.99) on S. aureus, where R was the bacterial reduction (log CFU/mL), X1 was the concentration and X2 was the contact time. Our predictive reduction models should be validated in developing the optimal concentration and contact time of ClO2 for inhibiting E. coli and S. aureus on food contact surfaces.


대장균과 황색포도상구균에 대한 이산화염소의 살균소독력 평가 및 살균예측모델 개발

윤소정, 박신영, 김용수1, 하상도*
중앙대학교 식품공학과
1한국보건산업진흥원

초록


    Ministry of Food and Drug Safety
    16162위생안014

    겨울에도 빈번히 발생하는 식중독에 대한 걱정은 끊이 지 않고 있다. 이러한 식중독은 식중독유발 병원균이 식 품을 통해 이입되어 발생할 수 있지만 식품의 조리과정 중 조리기구 및 용기·포장 등을 통해서도 간접적으로 발 생할 수 있다. 또한 병원균이 식품접촉표면에 옮겨지면 살 균소독제에 대한 저항성이 증가된다고 알려져 있다1-4). 따 라서 식품과 접촉하는 기구등의 적절한 세척과 살균소독 제가 효과적으로 발휘하는 사용농도 및 접촉시간은 식품 의 안전을 확보할 수 있는 중요한 관리항목이다.

    현재 국내 식품첨가물공전에는 기구등의 살균소독제 유 효성분으로 에탄올, 차아염소산나트륨, 요오드, 과산화수 소, 과산화초산 등 94종이 고시되어 있다5). 이러한 유효성 분은 크게 알코올계, 염소계, 요오드계, 과산화물계, 4급암 모늄계 등으로 분류된다. 살균소독제 중 염소계가 가장 널 리 사용되고 있는데 대표적인 것으로는 차아염소산나트륨, 이염화이소시아뉼산나트륨 등이 있으며 이 중에서도 많이 이용되고 있는 것은 차아염소산나트륨이다. 차아염소산나 트륨은 사용방법이 매우 간편하고 저렴하다는 장점이 있 지만 살균소독 후 유기물질과 반응하여 트리할로메탄이나 클로로포름 등과 같은 발암성 물질 생성으로 안전성이 문 제되고 있다6-8). 이러한 이유로 차아염소산나트륨의 단점 을 해결할 수 있는 대체 살균소독제로 이산화염소가 주목 받고 있다. 지금까지는 안전성, 경제성, 그리고 휘발성의 문제점 때문에 국내에서는 식품산업 적용이 활발히 진행 되지 않아 널리 사용되지 못하였지만, 이러한 문제점을 해 결하여 현재는 식품용 기구등의 살균목적으로 2012년부터 한시적 기준규격으로 인정되어 기구등의 살균소독제로 신 규 지정되었다. 지정된 사용범위는 식품접객업용 기구, 집 단급식소용 (1회 50인 미만 제공 급식소용 포함) 기구, 유 가공용 기구, 식품의 제조 및 가공용 기구에 대하여 모두 200 ppm 이하이다.

    따라서 본 연구는 대장균과 황색포도상구균에 대한 기 구등의 살균소독제인 이산화염소의 농도별 접촉시간에 따 른 살균소독력 평가와 살균예측모델을 개발하여 식품산업 현장의 적용을 위한 기초자료로 활용하고자 수행되었다.

    Materials and Methods

    시험균주

    Escherichia coli ATCC 10536과 Staphylococcus aureus ATCC 6538은 본 실험실에서 30% glycerol stock으로 −80°C 에서 보관중인 균주를 사용하였다. 보존 배양된 각 시험 균주는 Tryptic soy broth (TSB; BD사, NJ, USA)에 접종 하여 활성화시킨 후 Tryptic soy agar (TSA; BD사, NJ, USA)에 계대하여 37°C에서 18~24시간 배양하였다. 같은 방법으로 2차 배양과 3차 배양으로 활성화된 균만을 사용 하였다.

    시험용액

    이산화염소 (유효염소: 200 ppm)는 Life-clean사 (UDD, Sweden)로부터 제공받아 유효염소가 5, 20, 35 ppm이 되 도록 경수로 희석하여 사용하였다.

    살균소독력 평가방법

    살균소독력 평가방법은 식품첨가물공전의 희석중화시험 법을 사용하였다9). 멸균시험관에 간섭물질 1.0 mL와 시험 균 현탁액(E. coli 또는 S. aureus) 1.0 mL를 넣어 혼합하고 20 ± 1°C에서 2분 ± 10초 동안 방치한 후, 이산화염소 8 mL 를 넣어 20 ± 1°C에서 t분 ± 10초 (t = 1, 3, 5) 동안 반응시 켰다. 반응이 종료되면, 이 반응혼합액 1.0 mL를 중화제 8.0 mL와 멸균증류수 1 mL가 들어있는 멸균시험관에 넣고 20 ± 1°C에서 5분 ± 10초 동안 중화시켰다. 중화가 종료되면 희석액으로 serial dilution을 실시하고, 각 희석배수의 중 화반응혼합액 1 mL씩을 페트리접시에 각각 넣고 TSA를 가하여 잘 섞은 후 36 ± 1°C에서 24시간 배양하였다. 페트 리접시로부터 발생한 최대집락수를 세고 이산화염소의 살 균소독작용에 의한 생균수 감소율을 계산하였다. 이때 생 균수 감소율이 105 이상일 경우에 99.999% 이상의 살균 소독력을 나타낸다고 판정하였다.

    희석액(Tryptone sodium chlorine solution)의 조제

    Tryptone, pancreatic digest of casein (BD사, NJ, USA) 1.0 g, NaCl 8.5 g을 증류수 1 L에 녹인 후 멸균하여 사용 하였다.

    중화제(기본중화혼합제)의 조제

    Lecithin 3 g, polysorbate80 30 g, sodium thiosulfate 5 g, L-histidine 1 g 및 saponine 30 g에 희석액(TSCS)을 가하여 1 L로 만든 용액을 멸균하여 사용하였다.

    경수의 조제

    용액 A (MgCl2 19.84 g와 CaCl2 46.24 g을 증류수에 용 해하여 1 L로 맞춘 용액) 6.0 mL와 용액 B (NaHCO3 35.02 g을 증류수에 용해하여 1 L로 맞춘 용액) 8.0 mL에 증류 수를 첨가하여 1 L로 만든 뒤 pore size가 0.45 μm 이하인 여과막으로 제균하여 사용하였다.

    간섭물질의 조제

    청정조건의 모사를 위하여 Albumin, from bovine serum (Sigma-Aldrich사, MO, USA) 0.3 g을 증류수 100 mL에 녹 인 뒤 여과막으로 제균하여 사용하였다.

    실험 조건 및 분석

    이산화염소의 사용농도와 접촉시간에 따른 E. coliS. aureus의 감소 추이를 살펴보고 살균예측모델을 개발하기 위하여 Design-Expert (Version 10, Stat-Ease, Inc., MN, USA)에 의한 반응표면분석법(Response surface methodology, RSM)을 사용하였다(Table 1). 또한 각 조건별 유의성 검 증 및 예측식의 적합성을 확인하기 위해 분산분석(Analysis of variance, ANOVA)을 실시하였다.

    Results and Discussion

    식중독유발 병원균을 대상으로 살균소독제 유효성을 평 가한 연구들이 다수 보고되고 있다. 이 중 E. coli는 그람 음성, S. aureus는 그람양성을 대표하는 균주로써 가장 오 랫동안 광범위하게 연구에 사용되었다. 조작이 비교적 쉬 워 살균소독력 평가시 가장 많이 사용되고 있기 때문에 유럽 표준화위원회(Comité Européen de Normalisation, CEN)의 표준분석법, 미국 공인분석화학회(Association of Official Analytical Chemists, AOAC)의 표준분석법 등 국 제표준기구와 일부 선진국 시험법에서도 E. coli ATCC 10536과 S. aureus ATCC 6538은 살균소독제에 대한 유효 성을 평가하는 지표미생물로 명시되고 있다. 따라서 본 연 구에서 살균소독력 평가를 위한 시험균주로 E. coli ATCC 10536과 S. aureus ATCC 6538을 선택하였다.

    이산화염소의 사용농도와 접촉시간에 따른 살균소독력 평 가 및 살균예측모델 개발

    살균소독력은 살균소독제의 유효성을 판단하는 가장 중 요한 항목이다. 식품의약품안전처에서 고시한 ‘식품등의 한시적 기준 및 규격 인정 기준’에 의하면10) (식약처 고시 제 2017-36호) 살균소독력 시험에서는 20 ± 1°C에서 5분 ± 10초 동안 처리하였을 때, 2종의 지표균주(E. coliS. aureus)를 5 log(생균수 감소율 99.999%) 이상 감소시켜야 살균소독제로 인정한다.

    E. coliS. aureus에 대한 중심합성계획법(Central Composite Design, CCD)으로 디자인 된 이산화염소의 사용농 도와 접촉시간별 처리효과를 Fig. 1와 Table 2에 나타내었 다. 이산화염소의 농도와 접촉시간이 증가할수록 E. coliS. aureus에 대한 살균소독력이 증가하였다. 세척을 충 분히 수행한 조건을 모사하기 위하여 간섭물질을 첨가한 청정조건에서 E. coli의 경우, 초기균수가 9.13 log CFU/mL 이었으나 5 ppm의 이산화염소 처리 1분, 3분, 5분 후에는 각각 0.04, 0.07, 0.10 log CFU/mL 감소하였고, 20 ppm에 서는 각각 0.74, 0.79, 0.84 log CFU/mL 감소하였다. CCD 에 의한 최대농도 35 ppm에서는 2.49, 2.70, 3.65 log CFU/ mL 감소하였으며, 40 ppm 처리 5분 후에는 5 log 이상 감 소하여 생균수 감소기준을 만족하였다. S. aureus의 경우 초기균수가 8.70 log CFU/mL이었으나, 5 ppm의 이산화염 소 처리 1분, 3분, 5분 후에는 각각 0.14, 0.28, 0.36 log CFU/mL 감소하였고, 20 ppm에서는 각각 0.66, 0.79, 0.90 log CFU/mL 감소하였다. CCD에 의한 최대농도 35 ppm 에서는 4.59, 5.25, 5.81 log CFU/mL 감소하였으며, 40 ppm 처리 5분 후에는 5 log 이상 감소하여 생균수 감소기준을 만족하였다. 따라서 E. coliS. aureus에 대한 이산화염 소의 살균소독력을 평가한 결과 두 균주 모두 허용되는 최대농도(200 ppm) 보다 훨씬 낮은 40 ppm에서 식품의약 품안전처 살균소독력 기준에 만족하는 것으로 나타났다.

    Huang11) 등의 연구에서는 E. coli의 경우 1.4 ppm 이산 화염소 처리 20분 후에는 99%, 3.0 ppm 처리 20분 후에는 99.9%가 감소되었다고 보고하였고, S. aureus의 경우 1.5 ppm 처리 20분 후에는 98%가 감소되었다고 보고하였다. 이러한 결과는 본 연구의 결과와 비교시 살균소독제의 처 리시간이 본 연구의 이산화염소 최대 5분 처리 보다 4배 의 처리시간을 사용했기 때문이라고 사료된다. 또한 Foschino12) 등의 연구에서는 0.7 ppm 이산화염소를 처리하 였을 때 E. coli의 90%가 사멸될 수 있는 접촉시간은 약 2 분, 1.4 ppm을 처리하였을 때는 약 20초, 3.5 ppm을 처리 하였을 때는 약 7초라고 보고하였다. 이는 본 연구와 다른 1 : 100 (시험균 현탁액 : 이산화염소)으로 매우 높은 이산 화염소 비율을 사용했기 때문에 단시간 처리 및 낮은 농 도 사용에도 효과가 우수하게 나타났다고 사료된다. 이와 대조적으로 5 ppm 이산화염소로 1, 5, 10분간 처리한 후 의 E. coli는 각각 0.09, 0.18, 0.21 log CFU/mL, 10 ppm으 로 1, 5, 10분간 처리한 후에는 각각 0.31, 0.46, 0.60 log CFU/mL, 20 ppm으로 1, 5, 10분간 처리한 후에는 각각 0.71, 0.84, 1.05 log CFU/mL 감소되었음을 보고한 Ryu13) 등의 연구와 비슷한 결과를 보였다. 또한 Youm14) 등의 연 구에서도 pure cell culture의 조건에서 이산화염소 5 ppm 은 완전한 살균효과를 보이지 않음을 확인하였다고 보고 하였다.

    그 동안 기구등의 살균소독제는 사용 후 헹구는 제품과 헹구지 않는 제품으로 관리돼 왔다. 사용 후 헹구는 제품 은 유효성분을 과량 사용해 제조해도 안전성 평가를 면제 받을 수 있어서 많은 제조업자들이 고농도의 살균소독제 를 제조해 왔으며, 이로 인해 환경오염과 안전성에 문제 가 되어 왔다. Ölmez15) 등도 지금까지 주로 사용되고 있 는 염소계 살균소독제는 차아염소산나트륨 제품으로 환경 오염 및 건강상의 위험 때문에 일부 유럽국가에서 사용을 금지하였다고 보고하였다. 또한 Kim16) 등도 과도한 살균 소독제 사용이 독성학적, 환경오염 등의 문제를 야기할 수 있으므로 살균소독제의 실제 사용 환경에 따라 적절하게 사용되는지를 확인하기 위한 연구가 필요하다고 제안하고 있다. 본 연구에서 이산화염소는 허용되는 최대농도 200 ppm과 최대접촉시간 5분까지 처리하지 않아도 생균수 감 소기준인 5 log 이상의 감소값을 나타내었다. 따라서 본 연구에서 제시한 살균예측모델을 통해 E. coliS. aureus 를 제어할 수 있는 이산화염소의 적절한 사용농도와 접촉 시간을 얻을 수 있다. 이에 따른 반응표면분석법을 활용 하여 얻어진 2차 살균예측식은 Table 3에 나타내었다. R2 값이 E. coli는 0.98, S. aureus는 0.99로 모두 1에 근접하 는 높은 적합성을 보였다.

    E. coliS. aureus의 사멸예측모델의 적합성을 평가하 기 위해서 표준화 잔차의 정규확률을 구하였다(Fig. 2). 오 차의 분포가 정규분포를 따를 때 정규성을 가진다고 보는 데 표준화 잔차의 정규확률 그림에서 잔차들이 직선모형을 따를수록 오차의 정규성을 가정할 수 있다. 따라서, E. coliS. aureus를 제어하기 위한 이산화염소 처리 결과에 대 한 살균예측모델이 적절함을 확인하였다.

    본 연구에서 개발된 이산화염소의 살균예측모델을 식품 산업에서 활용함으로써 E. coliS. aureus를 최적의 살균 소독제 농도와 접촉시간으로 제어할 수 있을 것으로 사료된다.

    Acknowledgement

    본 연구는 2017년도 식품의약품안전처의 연구개발비 (16162위생안014)로 수행되었으며 이에 감사드립니다.

    Figure

    JFHS-32-507_F1.gif

    Response surface plots showing the interaction between concentration of ClO2 and contact time for reduction value of (A) E. coli and (B) S. aureus.

    JFHS-32-507_F2.gif

    Normal plots of residuals for predictive model to reduce (A) E. coli and (B) S. aureus by ClO2.

    Table

    CCD within the given range of concentration and contact time of ClO2

    Observed and predicted reduction value of E. coli and S. aureus after treatment with ClO2

    1)Reduction, log CFU/mL
    2)PI, prediction interval
    3)% of reduction value

    Response surface quadratic polynomial equation for reduction of E. coli and S. aureus based on concentration and contact time of ClO2

    1)R, reduction reduction; X1, ClO2 concentration; X2, contact time

    Reference

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