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ISSN : 1229-1153(Print)
ISSN : 2465-9223(Online)
Journal of Food Hygiene and Safety Vol.33 No.1 pp.77-82
DOI : https://doi.org/10.13103/JFHS.2018.33.1.77

Protective Effect of Eriobotrya japonica Lindl. on Hepatotoxicity by Carbon Tetrachloride

Yu-Bin Shin, Bae-Jin Ha1*
Department of Green-Chemistry TECH plus, Silla University, Busan, Korea
1Department of Pharmaceutical Engineering and College of Medical Life Scinece, Silla Univeristy, Busan, Korea
Correspondence to: Bae-jin Ha, Department of Pharmaceutical Engineering and College of Medical Life Science, Silla University, 140 Baegyang-daero 700beon-gil, Sasang-Gu, Busan 46958, Korea 82-51-999-5466, 82-51-999-5636bjha@silla.ac.kr
20170818 20170910 20171118

Abstract

This study was carried out to investigate the effect of natural Eriobotrya japonica Lindl. vinegar on the liver protective effect of animals exposed to carbon tetrachloride. Eriobotrya japonica Lindl. vinegar (200 mg/kg) was administered at the same time for 28 days, and hepatotoxicity was induced by intraperitoneal injection of carbon tetrachloride on the 29th day. The aspartate aminotransferase and alanine aminotransferase levels were significantly decreased (p < 0.001) and the superoxide dismutase and catalase activities were significantly increased (p < 0.001) in the Eriobotrya japonica Lindl. vinegar group compared to the control group. Histopathological observations showed that the Eriobotrya japonica Lindl. vinegar showed hepatic cell structure similar to normal group, and these results showed that it had an effect of suppressing and protecting the damage of liver cell. Therefore, Eriobotrya japonical Lindl. vinegar is considered to be a healthy functional food of the liver.


비파식초의 사염화탄소에 의한 간독성 보호 효과

신 유빈, 하 배진1*
신라대학교 그린화학융합공학과
1신라대학교 바이오과학과 제약공학과

초록


    Ministry of Trade, Industry and Energy

    인체는 많은 환경 오염물질과 약물 중독과 화학물질, 의 약품 등에 노출되어 있으며, 최근 20년동안 서구화된 식 생활 습관으로 인한 고지혈증, 순화기계 질관과 지방간, 비반 등의 다양한 질환의 생성으로 인해 사망률이 꾸준하 게 증가되고 있는 실정이다2,26).

    사염화탄소는 간 손상을 일으키는 대표적인 독성물질로, 생체 내에서 cytochrome P450에 의하여 trichloromethyl peroxyl radical (OOCCl3)가 생성되어 이 radical이 간독성 을 유발 시킨다21). 간세포의 사멸과 간암, 지방성 퇴행(fatty degeneration), 간 섬유증(fibrosis) 등을 유발시키고, CCl3 radical이 소포체의 불포화 지방산을 공격하여 세포막에서 지질과산화를 일으키고, 세포내의 단백질이나 지질 등의 macromolecules와 결합하여 간의 괴사가 활성화 되며, Kupffer cell이라는 대식세포를 활성화 시켜 염증을 생성 하게 된다10,25,26).

    비파(Eriobotrya japonica Lindl.) 나무는 장미과의 상록 교목으로, 잎은 타원상의 난형이며 백색의 꽃과 황색의 열 매로 중국이 원산지이지만 일본과 한국에서 많이 재배되 고 있으며 특히 우리나라에서는 제주도와 전라남도 등 혼 화한 기후의 지역에서 많이 재배되고 있다6,8). 비파나무의 잎은 엽차로 많이 이용되고 있으며 민간요법으로 청폐, 진 해, 기관지염, 거담, 딸꾹질 및 부종 등에 효능이 있다고 알려져 있다. 열매는 과육이 연하고 당도가 높아 식용하 기에 좋은 기호성 식품인 과실로, carotenoid 색소를 많이 함유하고 있다6,9). 비파에 대한 연구로는 아질산염 소거 및 항 돌연변이 효과4), 혈당 저하14), 항균 및 항산화 활성3), 항암 효과7) 등이 보고되어 있는 실정이다. 그러나 비파에 대한 용매별로 추출한 연구는 다양하지만 비파를 식초에 숙성시켜 간 손상에 대한 보호 효과에 대한 연구로는 거 의 부족하다.

    따라서 본 실험에서는 비파 식초를 이용하여 사염화탄 소로 흰 쥐에게 간독성을 일으켰을 때 생체 내에서 간독 성 보호 효과 작용 가능성을 알아보고 기초 자료로 제공 하고자 한다.

    Materials and Methods

    재료

    실험에서 사용된 비파 식초는 최혜빈의 비파 식초에서 제공을 받았고, 비파 식초의 제조 방법은 다음과 같다. 비 파나무의 잎과 열매를 깨끗하게 세척한 뒤 24시간 동안 건조 시킨다. 건조한 잎 30 kg과 열매 20 kg의 중량 비로 혼합하여 1년 동안 서늘한 곳에 숙성 시킨다. 혼합된 잎 과 열매 80%와 양조 식초 20%를 혼합하여 25~28°C의 온 도에서 6개월간 숙성시키며 총 용량은 1 L로 기준을 두었 다. 이렇게 숙성된 비파나무의 잎과 열매를 이용한 비파 식초를 실험에 사용하였다.

    실험동물

    실험동물은 Sprague-Dawley계 암컷인 6주령 흰 쥐를 (주) 샘타코 코리아(Osan, Korea)로부터 구입하여 사용하였고, 사육기간 동안에는 일반 식이와 물은 자유롭게 섭취시켰 다. 각 연구에 사용되는 동물은 난괴법(Rando-mized complete block design)에 의하여 5마리씩 4군으로 나누어 분 리시켰으며 각각의 그룹은 정상군(NOR, water), 음성대조 군(N-CON, CCl4, water), 양성대조군(P-CON, CCl4, milk thistle), 비파식초군(EJV, CCl4, Eriobotrya japonica Lindl. vinegar)으로 나누어 실험하였다(Table 1). 4주간 비파 식 초와 밀크 씨슬을 200 mg/kg의 비율로 매일 같은 시간에 주 7회로 경구투여 하였으며, 4주간 샘플 처리가 끝난 후 29일째 되는 날 실험 동물에 간 손상을 유발시키기 위해 사염화탄소와 olive oil을 1:1 비율로 혼합하여 3.3 mL/kg 의 용량으로 1회 복강 투여하여 간 손상을 일으켰다. 그 후 18시간동안 절식 후 CO2로 마취하여 개복 후 하대정 맥에서 혈액을 얻었으며, 4엽의 간을 전부 적출하여 식염 수로 세척하였다. 혈청을 얻기 위해 혈액은 10분 동안 3000 rpm에서 원심 분리하여 얻었으며 적출한 간과 함께 −70°C deep freezer에 보관하였다 (신라대학교 동물윤리위 원회에서 인증 받음. SUACUC-2016-005).

    혈청에서의 AST and ALT 수치 변화

    혈액에서의 생화학적 분석은 혈청중의 Aspartate aminotransferase (AST)와 Alanine aminotransferase (ALT) 활성 을 자동 생화학분석기(Fuji Dri-Chem 3500, Fujifilm)으로 측정하였다.

    간에서의 단백질 정량

    단백질의 정량은 간 시료를 0.5 g 취하여 2.5 mL의 0.05 M phosphate buffer (pH 7.4)에 homogenation 시킨 것을 시 료로 하며, Lowry 법22)에 의해서 실험을 진행하였다. D.W 4 mL과 시료 20 μL 혼합액 중에 1 mL을 튜브에 넣고 5 mL alkaline solution (100 mL Na2CO3 solution과 2 mL의 CuSO4, Na-K tartrate)을 첨가한 뒤 10분간 반응시킨다. 여기에 0.5 mL의 foline 시약을 넣고 20분간 반응시킨 뒤 750 nm 에서 흡광도를 측정하고 표준 단백 시료를 Bovine Serum Albumin (BSA)으로 하였다.

    간에서의 CAT 활성 수치 변화

    CAT 효소 활성 측정은 Aebi법1)으로 측정하였다. Phospate buffer (0.05 M, pH 7.0) 1.9 mL에 0.1 mL의 간 균질액 (homogenate, mitochondrial fraction을 1000 × g에서 10분 간 원심분리 한 상등액)을 첨가하여 잘 혼합한다. 혼합한 뒤 H2O2 용액 1 mL을 첨가한 뒤 Elisa (Microtiter plate reader, Molecular Devices Co., Sunnyvale, CA, USA)를 이 용하여 240 nm에서 1분 30초간 측정하였다. CAT 활성도 의 표기는 nmol/mg protein으로 하였다.

    간에서의 SOD 활성 수치 변화

    SOD 효소활성 측정은 Beauchamp와 Fridovich 법5)의 변 형된 방법에 따라서 0.2 M K-phosphate buffer (pH 7.4)를 672 μL, 1 mM xanthine 100 μL, 1% sodium deoxychlorate 300 μL, 1.5 mM KCN 300 μL, 0.2 mM cytochrome C 1500 μL를 넣은 혼합액에 간 균질시료 80 μl를 넣고, xanthine oxidase 원액 10 μL를 넣은 후 Elisa (Microtiter plate reader, Molecular Devices Co., Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 550 nm에서의 흡광도 변화를 2분 동안 측정하였다. 효소 활성도는 Sigma사의 superoxide dismutase standard를 표 준액으로 사용하여 측정하였다.

    간 조직학적 병변 관찰

    간 조직을 10% formaldehyde 용액에 48시간 정도 고정 시킨 후, 70%, 80%, 90%, 100% ethanol에서 순차적으로 각각 탈수시켰다. 탈수시킨 조직을 xylene 처리 후, paraffin 으로 포매 하고 microtome을 이용하여 4 μm의 조직 절편 으로 잘라서 slide glass에 올려놓았다. 일반적인 염색 방 법은 hamatoxylin-eosin으로 염색한 후, 광학현미경으로 간 조직을 관찰하였다.

    Results

    혈청에서의 AST, ALT 수치 변화

    AST와 ALT는 손상된 간에서 혈액으로부터 나오는 효 소 활성도 측정 방법 중 하나로 혈청 aminotransferase 활 성의 변화는 간 손상과 간 보호의 지표로 사용되어 왔다11,17).

    혈청에서의 AST와 ALT 수치 변화는 Fig. 1에 나타내었 다. AST 활성 수치 변화는 NOR군은 86.67 ± 6.66 mg/dL, P-CON은 72.00 ± 3.61 mg/dL, N-CON은 218.33 ± 6.11 mg/ dL, EJV군은 109.67 ± 6.81 mg/dL로, N-CON이 가장 높은 수치를 나타내었고 밀크씨슬과 사염화탄소를 투여한 PCON군이 가장 낮은 수치를 나타내었다. EJV군은 N-CON 군과 비교하였을 때 현저히 낮은 수치를 나타내고 있으며, N-CON군보다 통계적으로 유의한 차이로 49.77%로 감소 하였다(P < 0.001).

    ALT 활성 수치 변화는 NOR군은 55.67 ± 3.51 mg/dL, PCON군은 80.33 ± 8.50 mg/dL, N-CON군은 376.00 ± 3.61 mg/dL, EJV군은 90.67 ± 6.66 mg/dL로, 사염화탄소를 단독 으로 투여한 N-CON군이 가장 높은 수치를 나타내고 있 으며, 아무것도 처리하지 않은 NOR군이 가장 낮은 수치 를 보였다. EJV군은 N-CON군에 비하여 낮은 수치를 보 이고 있으며 유의한 차이로 75.88% 감소하였다.

    Lee19)의 연구에서는 알코올을 투여한 대조군이 정상군 보다 유의하게 증가하고 있는 경향을 보이고 있으며 비파 추출물과 알코올을 투여한 군은 대조군에 비하여 수치가 낮아지는 것으로 나타났다.

    또한 Kim 등12)의 연구에서는 고지방식이를 투여한 흰 쥐에게 비파 잎 에탄올 추출물을 투여하였을 때 혈청 AST 및 ALT 활성이 대조군에 비하여 유의하게 감소하였으며, 비파 잎 에탄올 추출물이 고지방식이와 알코올 투여로 인 한 간세포의 손상을 예방하고 회복시키는 효과가 있는 것 으로 보고되어 있다.

    따라서 혈청 중 AST와 ALT의 활성도를 유의적인 감소 를 나타내어 비파 식초가 간세포의 손상을 방어하며, 간 기능에 긍정적인 효과가 있는 것으로 사료된다.

    간에서의 CAT 활성 수치 변화

    CAT는 생체 내에서 H2O2를 H2O와 O2로 분해하여 조직 손상을 방어하는 효과가 있는 효소로 알려져 있다16).

    간 손상을 유발 시킨 흰 쥐 간의 균질액에서 CAT 활성 변화는 Fig 2와 같다. NOR군은 8.62 ± 0.10 mg/dL, 사염화 탄소와 밀크씨슬을 투여한 P-CON군은 6.73 ± 1.08 mg/dL, 사염화탄소를 단독 투여한 N-CON군은 1.80 ± 0.41 mg/dL, 사염화탄소와 비파식초를 투여한 EJV군은 4.77 ± 0.60 mg/ dL로, NOR군이 가장 높은 수치를 나타났고, N-CON군이 가장 낮은 수치를 나타났다. EJV군은 P-CON군보다 낮은 수치이지만 N-CON군보다 높은 수치로 62.26%로 유의적 으로 증가하였다(P < 0.001).

    Kim15)등의 연구에서는 알코올성 간 손상을 일으킨 C57BL/6 마우스에서 CAT 효소 활성 수치를 분석한 결과, 알코올에 의해 감소된 CAT 효소 활성을 확인 할 수 있었 고, 비파엽이 알코올로 인해 발생하는 활성산소를 제거하 여 대조군보다 CAT 효소 활성을 증가시켜 간 손상을 억 제하는 역할을 하는 것으로 보고되어 있다.

    따라서 본 연구에서는 비파 식초 또한 비슷한 결과가 나타나는 것으로 보아 활성산소를 제거하여 생체 내 대사 과정에서 생성되는 과산화물로부터 생체 조직을 보호하고, 간 손상을 방어하는 효과가 있는 것으로 확인 되었다.

    간에서의 SOD 활성 수치 변화

    SOD는 세포내에서 생성되는 활성 산소를 H2O2와 O2로 분해하여 산화적 손상을 방어하고 superoxide anion radical 을 과산화수소로 전환시켜 간 세포의 손상으로부터 보호 한다20,23).

    간 손상을 유발시킨 흰 쥐 간의 균질액에서 SOD 활성 수치 변화는 Fig. 3과 같다. NOR군은 9.08 ± 0.17 mg/dL, 사염화탄소와 밀크씨슬을 투여한 P-CON군은 7.08 ± 0.55 mg/dL, 사염화탄소를 단독으로 투여한 N-CON군은 2.77 ± 0.38 mg/dL, 사염화탄소와 비파식초를 투여한 6.61 ± 0.51 mg/dL로, 아무것도 처리하지 않은 NOR군이 가장 높은 수 치였으며 N-CON군이 가장 낮은 수치를 나타났다. EJV군 은 N-CON군과 비교하였을 때 58.09%로 유의한 차이로 증가하는 경향을 보였으며, 사염화탄소와 밀크씨슬을 투 여한 P-CON군과 비교했을 때 큰 차이가 없는 것으로 보 아, 간 기능을 향상시키는 시중에 판매하는 밀크씨슬 만 큼의 회복 효과가 있는 것으로 나타났다.

    CAT 효소 활성 결과와 마찬가지로 Kim 연구에 의하면 SOD 효소활성 수치는 대조군보다 비파엽을 투여한 동물 군이 유의하게 증가하는 것으로 확인 되었으며, 알코올성 간 손상을 억제시키는 성분을 가지고 있다고 보고되고 있다.

    따라서 본 연구에서 비파 열매와 비파 잎을 이용한 비 파 식초는 간에서의 SOD 활성 증가에 영향을 미쳐 간독 성 예방 효과가 있는 것으로 사료된다.

    간 조직에서의 병변 관찰

    사염화탄소 투여와 비파 식초를 투여한 흰 쥐의 간의 조직학적 변화를 관찰한 결과는 Fig. 4에 나타내었다. 사 염화탄소를 단독으로 투여한 N-CON군의 간 조직에서는 지방변성으로 인한 간 조직의 공포화 현상이 나타났으며 간세포의 괴사로 인한 간세포 구조가 일정하게 배열되어 있지 않은 것으로 나타났다(Fig. 4C). 밀크씨슬과 사염화 탄소를 투여한 P-CON군은 정상군과 비슷하게 간 조직 대 부분 정상적인 결과를 보여주었으며(Fig. 4B), 비파식초와 사염화탄소를 투여한 EJV군은 부분적인 지방변성으로 인 한 공포화 현상이 관찰되었고 간세포의 구조는 정상군과 비슷한 모양으로 일정하게 배열되어 있는 것으로 관찰 되 었다(Fig. 4D).

    Cho 등20) 연구에서는 CCl4를 투여한 흰 쥐의 간세포는 팽윤되고 지방변성과 공포화 현상 및 중심 정맥 주변으로 괴사가 일어난다고 보고되어 있다. 이는 사염화탄소 투여 에 의하여 간세포는 손상 및 괴사가 일어나게 된다.

    따라서 본 연구에서 비파 식초는 사염화탄소로 인한 간 손상을 억제하여 간 기능을 활성화 하는 효과가 있는 것 으로 사료된다.

    Discussion

    사염화탄소는 높은 간독성 작용을 일으키기 위해 trichloromethyl free radical은 산소와 결합하여 trichloromethyl peroxy free radical을 형성하여 세포막의 불포화 지방산을 과산화 시키고 막의 구조와 기능을 파괴하여 혈중 AST와 ALT를 유출시킨다13). 이 연구는 사염화탄소로 간 손상을 유도 하였을 때 비파 식초의 간 보호 효과에 대하여 평가 하기 위하여 실시되었다.

    비파 식초는 혈청 AST와 ALT 활성 수치가 사염화탄소 를 단독으로 투여한 음성대조군보다 유의한 차이(p < 0.001) 를 보여 간 보호 효과가 있는 것으로 나타났으며, 간 질환 을 예방하는 건강기능식품으로도 가능성이 있다고 사료된다.

    간조직 내에서 superoxide를 제거하는 SOD와 과산화수 소를 제거하는 catalase와 같은 항산화 효소들은 사염화탄 소로 인해 지질과산화 반응의 연쇄적인 반응 진행을 차단 하는 중요한 역할을 담당한다24). 사염화탄소만 단독으로 투여한 N-CON군은 catalase 및 SOD 효소 활성이 정상군 에 비해 현저하게 감소하는 경향을 보이고 있고 비파식초 와 사염화탄소를 처리한 EJV군은 catalase 및 SOD 효소 활성을 활성화 시키는 효과가 있어 N-CON군보다 유의하 게 증가(p < 0.001)하는 경향을 보였다. Kwon18)등의 연구 로 보아, SOD의 활성이 증가될 경우에는 catalase 활성도 함께 증가하는 것으로 알려져 있다고 보고되어 있다.

    간 조직학적 병변 관찰에서 사염화탄소만 단독으로 투 여한 N-CON군은 지방변성으로 인한 공포화 현상이 넓게 분포되어 있고 간세포의 구조가 일정하게 배열되어 있지 않으며 섬유화가 진행되는 것으로 나타났다. 반면 비파식 초와 사염화탄소를 투여한 EJV군의 간 조직은 지방변성 으로 인한 공포화 현성이 적게 분포되어 있고 정상군과 비슷한 간세포 구조로 배열되어 있으며 섬유화는 진행되 지 않은 것으로 보아 간 독성 예방에 뚜렷한 효과가 있는 것으로 밝혀졌다.

    따라서 본 연구는 비파식초를 4주간 처리하여 사염화탄 소로 간독성을 유도한 흰 쥐에게 간독성 예방 효과 정도 를 조사한 결과, 모든 데이터에서 사염화탄소로 간독성을 유도한 흰 쥐에서 비파식초가 간을 보호하는 예방 효과 결과를 보였으며, 이는 간독성에 대한 보호 효과를 가진 건강기능식품 소재 개발로 이용될 수 있을 뿐 만 아니라 더 나아가 약물 개발의 주요 소재로도 활용될 가능성이 있다고 사료된다.

    국문요약

    비파 식초가 사염화탄소에 의한 간독성에 대한 보호효 과를 흰 쥐를 이용하여 확인하고자 연구하였다. 4주간 SD rat 암컷을 정상군, 음성대조군, 양성대조군, 비파 식초군 으로 나누어 샘플을 처리하였고, 29일째 되는 날 사염화 탄소를 처리하였다. 혈청 AST 및 ALT 효소 활성 수치 변 화에서 비파 식초가 사염화탄소를 단독으로 투여한 군보 다 유의한 수치로 각각 49.77%, 75.88%로 감소하였다(p < 0.001). 간 조직에서는 CAT 및 SOD 효소 활성은 비파 식 초군이 사염화탄소를 단독으로 투여한 음성대조군보다 유 의한 차이로 높은 활성 수치를 보였다. 조직학적 관찰에 서는 비파식초군이 사염화탄소를 단독으로 투여한 음성대 조군에 비해 지방변성이 적게 분포하고, 조직의 섬유화가 진행되지 않았으며, 정상군과 비슷한 간세포의 구조가 관 찰 되었다. 이와 같은 결과를 보아 비파 식초는 항산화 효 소의 증가로 활성산소를 제거하여 간 손상을 억제할 뿐 아니라 혈청의 AST 및 ALT 효소 활성을 감소시켜 간 보 호 효과가 있는 것으로 건강기능식품으로써 긍정적인 가 능성이 있다고 사료된다.

    Acknowledgement

    본 연구는 2017년도 부산광역시에서의 재원(Brain Busan 21)와 2016년 산업통상자원부의 ‘창의산업융합 특성화 인 재양성사업’의 지원을 받아 수행되었음에 감사함을 전합니다.

    Figure

    JFHS-33-77_F1.gif

    Effect of Eriobotrya japonica Lindl. vinegar on AST and ALT levels in serum.

    NOR: Normal control group

    P-CON: Milk thistle (200 mg/kg body weight) + CCl4-treated (3.3 mL/kg body weight) group

    N-CON: CCl4-treated (3.3 mL/kg body weight) group

    EJV: Eriobotrya japonica Lindl. vinegar (200 mg/kg body weight) + CCl4-treated (3.3 mL/kg body weight) group

    All the values were expressed as means ± S.D. (n = 5)

    a,b,c are different (p < 0.001) group by one-way ANOVA followed by Duncan's post hoc test.

    JFHS-33-77_F2.gif

    Effect of Eriobotrya japonica Lindl. vinegar on AST and ALT levels in serum.

    NOR: Normal control group

    P-CON: Milk thistle (200 mg/kg body weight) + CCl4-treated (3.3 mL/kg body weight) group

    N-CON: CCl4-treated (3.3 mL/kg body weight) group

    EJV: Eriobotrya japonica Lindl. vinegar (200 mg/kg body weight) + CCl4-treated (3.3 mL/kg body weight) group

    All the values were expressed as means ± S.D. (n = 5)

    a,b,c are different (p < 0.001) group by one-way ANOVA followed by Duncan's post hoc test.

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    Effect of Eriobotrya japonica Lindl. vinegar on AST and ALT levels in serum.

    NOR: Normal control group

    P-CON: Milk thistle (200 mg/kg body weight) + CCl4-treated (3.3 mL/kg body weight) group

    N-CON: CCl4-treated (3.3 mL/kg body weight) group

    EJV: Eriobotrya japonica Lindl. vinegar (200 mg/kg body weight) + CCl4-treated (3.3 mL/kg body weight) group

    All the values were expressed as means ± S.D. (n = 5)

    a,b,c are different (p < 0.001) group by one-way ANOVA followed by Duncan's post hoc test.

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    Histopathologic examination of liver tissue of Eriobotrya japonica vinegar and CCl4-treated rat (H&E Staining, 400 ×)

    A: Normal control group (NOR)B: Milk thistle (200 mg/kg body weight) + CCl4-treated (3.3 mL/kg body weight) group (P-CON)C: CCl4-treated (3.3 mL/kg body weight) group (N-CON)D: Eriobotrya japonica Lindl. vinegar (200 mg/kg body weight) + CCl4-treated (3.3 mL/kg body weight) group (EJV)

    Table

    Experimental design of rats

    NOR: Normal control group.
    N-CON: CCl4-treated group.
    P-CON: Milk thistle + CCl4-treated group.
    EJV: Eriobotrya japonica Lindl. vinegar + CCl4-treated group.

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