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ISSN : 1229-1153(Print)
ISSN : 2465-9223(Online)
Journal of Food Hygiene and Safety Vol.33 No.1 pp.50-57
DOI : https://doi.org/10.13103/JFHS.2018.33.1.50

Rapid Detection for Salmonella spp. by Ultrafast Real-time PCR Assay

Seok Hwan Kim, Yu-Si Lee, In-Sun Joo, Hyo Sun Kwak, Gyung Tae Chung, Soon Han Kim*
Food Microbiology Division, National Institute of Food and Drug Safety Evaluation, Ministry of Food and Drug Safety, Cheongju, Korea

† Both authors contributed equally to this work

Correspondence to: Soon Han Kim, Food Microbiology Division, National Institute of Food and Drug Safety Evaluation, Ministry of Food and Drug Safety, Cheongju 28159, Korea 82-43-719-4308, 82-43-719-4300lambndog@korea.kr
20170512 20170617 20171121

Abstract

Salmonella continue to be a major cause of food poisoning worldwide. The rapid detection method of food-borne Salmonella is an important food safety tool. A real-time polymerase chain reaction (PCR) has been used as a rapid method for the detection of pathogens. It has been recently reported that NBS LabChip real-time PCR is a novel, ultrafast, and chip-type-convenient real-time PCR system. We developed the assay method based on NBS Lab- Chip real-time PCR for the rapid detection of Salmonella, which its reaction time was within 20 minutes. Two target genes (invA and stn) were selected to design target specific primers and probes. The new method was validated by checking specificity and sensitivity (limit of detection). This study included forty-two target and twenty-one non-target strains to assess the specificity. This assay was able to identify the 42 Salmonella strains correctly. The limit of detection (LOD) was 101 copies/μL in Salmonella genomes DNA, while LOD incubated for 4 hr in the inoculated sausage sample ranged from 101 CFU/g to 102 CFU/g as an inoculated cell count. The assay developed in this study could be applied for the investigation of food poisoning pathogens.


Ultrafast Real-time PCR법을 이용한 살모넬라의 신속 검출

김 석환, 이 유시, 주 인선, 곽 효선, 정 경태, 김 순환*
식품의약품안전처 식품의약품안전평가원 식품위해평가부 미생물과

초록


    Ministry of Food and Drug Safety

    세균성 식중독의 주요 병원균으로는 Salmonella spp., Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Vibrio parahaemolyticus, Clostridium perfringens 등을 들 수 있다1). 이 중 Salmonella에 의한 식중독 사고는 전 세계적으로 가장 많이 발생하고 있으며, 매년 340만 건이 발생하고 치사율 이 20%로 보고되고 있다2,3). 국내에서 발생한 살모넬라 식 중독은 지난 15년 간 보고에 따르면 연간 약 20건씩 발 생하고 있으며, 국외에서는 연간 2~13억 건에 이르고 중 국의 경우 세균성 식중독 사고의 70% 이상이 살모넬라로 인해 발생된다고 보고되고 있다4,5). 실제로 식품의약품안전 처 식중독 발생통계에 따르면 2016년 국내에서 발생한 살 모넬라 식중독은 21건으로 354명 환자가 발생한 것으로 보고되고 있다6).

    살모넬라는 동물의 장내에서 서식할 수 있는 장내세균 과로 닭, 소, 돼지 등 가축의 장관 및 토양과 물 등 자연 계에 널리 분포하고 있다7). 주로 살모넬라균이 오염된 식 품이나 가축의 매개 형태로 발생하여 장독소(enterotoxin) 를 생성하여 48시간 이내에 위장염을 일으켜 설사, 발열, 복통, 장티푸스 등 심각한 질병을 발생시키기도 한다8-14). 특히 영유아, 노인, 면역이 저해된 사람에게 감염 시 임상 증상은 중증에서 사망까지 이르는 치명적인 결과를 야기 할 수 있다8,15). 살모넬라는 현재까지 약 2,500여 종류의 다양한 혈청형이 보고되었고, 이 가운데 Salmonella enterica serotype Enteritidis (S. Enteritidis)와 Salmonella enterica serotype Typhimurium (S. Typhimurium)가 식중독 사고를 일으키는 대표적인 혈청형으로 알려졌다5). 이들 균주는 감 염 및 발병 대상에 대한 특이성이 없어 동물과 사람 모두 에서 식중독을 일으키는 것으로 알려져 있다16,17). 이처럼 살모넬라는 식중독을 일으키는 주요 원인균으로서 식중독 사고를 방지하고 식품산업 및 공중보건의 측면에서 신속 정확한 검출이 매우 중요하다18).

    일반적인 살모넬라 표준검출법으로는 선택 배지를 이용 한 배양법이 사용되지만, 이 시험법은 증균배양, 분리배양, 생화학 시험 등의 과정이 필요하기 때문에 5일 이상의 장 시간이 소요되며 많은 노동력이 필요하다6,8). 이러한 배양 에 의한 시험방법은 국제적으로 식중독 원인체 규명을 위 한 표준 시험법으로 널리 통용되고 있지만 신속한 결과를 규명하기에는 시간적으로 한계점이 따른다. 식중독 세균의 신속 검출법(rapid method)으로는 ELISA (Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay), 직접형광항체법, 유전자 기반의 검출 방법인 DNA hybridization과 PCR (Polymerase Chain Reaction)법이 널리 응용되고 있다19). 그 중 Polymerase chain reaction (PCR)법은 식중독균의 특정 유전자를 증폭 시켜 전기영동 겔을 통해 확인하는 방법으로 단시간 내에 결과를 도출하고 높은 특이도와 민감도를 나타낸다8,20,21). 특히 real-time PCR법은 추가적인 전기영동 과정 없이 실 시간으로 검출 결과를 확인할 수 있어 병원체 신속검사법 으로 적용되고 있다22). 최근에도 병원체를 신속하게 검출 하기 위해 다양한 real-time PCR 시스템이 개발되고 있으 며, 20분 이내로 PCR 반응이 가능한 칩타입의 초고속 realtime PCR 시스템(NBS Labchip G2-4)이 보고되어 감염병 진단에 활용되고 있다23,24). 따라서 본 연구에서는 식중독 의 주요 원인균으로 알려진 살모넬라를 신속하게 검출하 기 위해 초고속 real-time PCR 기법을 이용하여 검출한계 (민감도)와 특이도를 확인하였다.

    Materials and Methods

    사용 균주 및 생화학 동정 확인

    Salmonella spp. 표준균주 9주와 식품 등에서 분리한 균 주(MFDS 균주) 33주 및 Non-target Salmonella spp. 21주 등 총 63주를 확보하여 VITEK 2 compact system (Bio- Merieux, Marcy I’Etoile, France)을 통해 생화학적 동정형 을 거쳐 확인한 후 실험에 사용하였다(Table 1).

    Primer/probe 제작

    Real-time PCR법에 사용된 primer와 probe 서열은 Salmonella의 병원성 유전자인 invA (GenBank accession no. DQ644631)와 stn (L16014)을 타겟으로 설계하였다. 각 각의 프라이머와 프로브는 primer 3 프로그램(http://www. primer3plus.com) 및 primer express 3.0.1 (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA)을 이용하여 설계하였다. 설 계된 프라이머의 특이성은 미국 NCBI 사이트(http://www. ncbi.nlm.nih.gov)에서 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)를 통해 검증하였다(Table 2). 합성 oligonucleotide primer와 probe는 바이오니아(Bioneer, Daejeon, Korea)에 주문 제작하여 사용하였다. 설계된 프로브의 5'에 FAM 형 광물질을 결합하였으며, quencher로서 3'에 BHQ1를 결합 하였다.

    Target 유전자에 대한 민감도 및 특이성

    제작한 프라이머와 프로브의 검출한계는 invA gene 양 성 대조군의 경우 유전자 증폭부위를 합성하여 pBHA 벡 터에 삽입하여 플라스미드를 제작하였다(Bioneer, Daejeon, Korea). stn gene은 Salmonella Enteritidis ATCC 13076 순 수 배양액에서 DNA를 추출한 후 이로부터 얻은 plasmid DNA를 농도별(107~101 copies/μL)로 단계 희석하여 realtime PCR을 통해 민감도를 실험하였다.

    특이도 평가를 위해서 Salmonella spp. 균주 42주와 비 대상균주 21주를 대상으로 real-time PCR을 실시하였다. 또한 국내에서 동일 타겟으로 시판되고 있는 살모넬라 검 출 kit (KogeneBiotech, Seoul, Korea)로 real-time PCR (7500 Fast real-time PCR, Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA)을 시행하여, 두 real-time PCR법에 대한 결과 일치 도를 비교하였다.

    식품 적용 시 검출한계 평가

    제작된 NBS LabChip real-time PCR의 검출한계(detection limit)를 알아보기 위하여 순수 배양액(pure culture)과 식 품으로 나누어 실시하였다. 순수 배양액에서 검출한계를 알아보기 위하여 Salmonella Enteritidis ATCC 13076을 Tryptone Soya Broth (Oxoid, Basingstoke, Hampshire, UK) 에서 37°C, 24시간 배양하였다. 이를 0.85% 생리식염수로 10배씩 단계 희석(107~101CFU/mL)한 후 Tryptone Soya Agar (Oxoid, Basingstoke, Hampshire, U.K)에 도말하여 37°C, 24시간 배양 후 균수를 계산하였고, 이를 대조군인 증균 전 단계(before enrichment)로 적용하였다. 또한 식품 에서는 소시지에 10배수로 단계 희석한 살모넬라 배양액 1 mL을 접종시켜 30초간 균질화한 다음 4시간 증균 과정 을 거친 후에 검출하였다(after enrichment).

    순수 배양액과 식품 샘플에서의 배양액을 단계희석액 1 mL 취해서 원심 분리한 후 상등액은 버리고, 펠렛(pellet) 을 DNA isolation kit (Ultraclean microbial DNA isolation kit, Mo Bio Laboratories, Carlsbad, CA, USA)를 이용하 여 유전자를 추출 한 뒤 검출한계를 분석하였다.

    Real-time PCR 반응조건

    반응액의 조성은 PCR 튜브에 Master Mix (Nanobiosys, Seoul, Korea), primer/probe, DW를 7 μL이 되도 혼합한 후 시료 DNA 2 μL를 첨가하여 총량을 9 μL로 하였고, 이 를 8 μL씩 각 채널에 주입하였다. NBS LabChip real-time PCR (UltraFast real-time PCR G2-4 system, Nanobiosys, Seoul, Korea)를 사용하여 95°C 12초를 반응시킨 후 95°C 4초, 56°C 15초를 1회로 하여 총 40 cycles을 수행하였으 며, running time으로 18분이 소요되었다.

    Results and Discussion

    특이도 확인

    Real-time PCR의 특이도는 target만 검출해내는 inclusivity 와 non target은 검출하지 않는 exclusivity 결과로 평가하 게 된다. 본 연구에서는 invAstn 유전자를 target인 Salmonella 균주 42주에서 모두 검출하였고, non target 균 주 21주에서는 검출되지 않아 위양성, 위음성 결과가 나 타나지 않았음을 확인하였다(Table 1). 또한 기존에 살모 넬라 검출을 위해 사용되고 있는 국내 제품인 살모넬라 검출 kit (Kogenbiotech, Seoul, Korea)와 비교를 진행한 결 과, 모두 100% 일치하여 두 방법간 특이도 결과에 차이가 없었다(Table 1). Moore 등26)의 연구에서도 real-time PCR 을 이용하여 살모넬라 양성 균주에서 stn 유전자를 확인 하였다고 보고하여 본 연구와 같은 결과를 보였다.

    민감도 측정

    살모넬라 stninvA를 이용하여 자체 제작한 NBS LabChip real-time PCR의 민감도는 Figs. 1, 2, 3에 나타내 었다. stninvA 모두 101 copies/μL까지 검출이 가능하여 높은 민감도를 확인할 수 있었다(Figs. 1, 2). 검출한계를 구한 범위 내에서 real-time PCR이 최적화되었는지 평가 하기 위해 standard plot으로부터 얻어지는 R2 값이 0.98 이상인지를 평가한다25). 본 연구에서 stninvA의 정량 곡선으로부터 얻어진 R2 값은 각각 0.9961 및 0.9982의 신 뢰도를 입증하였다(Fig. 3). 또한 Salmonella Entritidis ATCC 13076 stn gene과 양성대조군 invA gene에 대한 NBS LabChip real-time PCR 반응액은 2% agarose gel에서 전 기영동하여 각각의 밴드를 확인한 결과, 각각 162 bp와 151 bp에서 특이적인 증폭산물을 확인하였다(Figs. 1, 2).

    식품적용 평가

    소시지에 살모넬라를 접종한 후 제작된 프라이머와 프 로브를 이용하여 real-time PCR을 수행한 결과를 Fig. 4에 나타내었다. 대조군인 증균 전 단계로 적용된 살모넬라 순 수배양액(before enrichment)의 경우 invAstn 모두 103 CFU/g이며, 접종 후 4시간 증균한(after enrichment) 결과 invA 유전자는 접종균수로서 101CFU/g, stn 유전자는 접 종균수로서 102 CFU/g 수준의 감도를 보였다(Fig. 4).

    식품으로부터 병원균의 검출은 특이성뿐만 아니라 민감 성 또한 매우 중요한 요인으로 작용한다27). Kumar 등28)의 연구에 따르면 살모넬라를 seeded fish에 접종하여 Chromo 4 Real-time system (MJ Research Corp., U.S.A.)을 통해 invA를 확인한 결과 20~106CFU/mL 검출이 가능하였다. Niu 등29)은 Fast real-time PCR (Applied Biosystems, USA) 을 이용한 우유에서 살모넬라를 102CFU/mL까지 검출하여 본 연구에서 사용한 real-time PCR과 비슷한 결과를 나타 냈다.

    선행 연구에 의하면 Malorny등30)은 육류 및 우유에서 Salmonella spp. 검출법에 있어서 배지 배양법보다 realtime PCR법이 100%의 높은 민감도와 특이도를 보여 realtime PCR법의 우수성을 발표하였다. Lee 등22)에 따르면 비가공식품에서 colony PCR법 보다 real-time PCR법이 보 다 많은 양성의 결과를 보여 더 효과적인 검사법이라고 하였고, 돼지고기에 S. aureus를 접종하였을 때 배지배양 법에 비해 효율성이 더 우수하다고 보고하였다. Jeong 등31)SalmonellaV. parahaemolyticus 균주에 혼합되어 있 는 S. aureus만을 검출하는 PCR법을 보고하였다. 또한 우 유, 치즈 등 유제품에서 Campylobacter coliC. jejuni 검출32)과 소시지 및 햄류에서 L. monocytogenes 검출을 보 고하는33) 등 이처럼 여러 분야에서 PCR법이 수행되고 있다.

    또한 우유에 살모넬라를 접종한 후 증균 시간에 따라 검출율을 비교한 결과 증균 단계를 거치지 않을 경우 103CFU/mL인 반면 18시간 이상 증균 할 경우 100 CFU/ mL을 나타냈다고 하였다34). Sharma 등35)도 고기에서 SalmonellaE. coli O157:H7를 인위적으로 접종하여 확 인한 결과 최소 6~18시간 배양해야 10 CFU/g까지 검출할 수 있어 증균 단계의 필요성을 발표하였다.

    이러한 결과를 종합하여 볼 때, PCR 법은 병원성 세균 을 분리, 배양 단계를 거치지 않고 존재 여부를 빠른 시 간 내에 확인할 수 있어 식품에서 미생물의 검출에 효과 적이다27).

    일반적으로 real-time PCR에 따른 식품에서 검출한계는 103~104 CFU/mL 수준이며 분석시간은 30분~90분이 소요 되지만21,36-38) 본 연구에서는 식품에서 높은 감도와 20분 내 에 결과를 도출할 수 있어 신속한 검출 속도를 나타내었 다. 또한 PCR 검출한계 이상의 결과를 얻기 위해서는 8 시간 이상의 증균 과정을 거쳐야 하지만39) 본 연구에서는 최소 증균 과정(4시간)을 거쳐 101~102CFU/mL 수준까지 검출이 가능하였다.

    따라서 본 연구에서 개발한 프라이머/프로브를 이용하 여 NBS LabChip real-time PCR법으로 4시간 동안 배양 한 증균액만으로 20분 내에 결과를 판정할 수 있기 때문 에 분석 시간 및 비용을 절감할 수 있고, 시료 내에 적은 농도로 존재하는 Salmonella 균을 검출할 수 있었다. 또한 식품에서 검출감도를 높이기 위해서는 최소 4시간 이상의 증균 과정을 거쳐야 할 것으로 사료된다. 최종적으로 본 연구에서는 SalmonellastninvA gene의 신속 검출법 을 마련하여 민감도와 특이성을 확인하였으며, 향후 식품 과 식중독 원인조사에 효율적으로 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

    국문요약

    Salmonella는 전세계적으로 식중독을 유발하는 주요 원 인 균으로서, 식중독을 유발하는 Salmonella를 신속하게 검출하는 방법은 식품 안전을 위한 중요한 도구이다. Realtime PCR은 식중독균을 검출하기 위한 신속검사법으로 널 리 사용되어 왔다. 최근에는 NBS LabChip real-time PCR 이라는 새로운 시스템이 칩타입으로 조작이 간편하며 초 고속의 real-time PCR 시스템이라는 보고가 있었다. 본 연 구에서는 살모넬라의 신속한 검출을 위하여 NBS LabChip real-time PCR에 기반하여 real-time PCR 반응 시간이 20 분 이내인 검출법을 확인하고자 하였다. 프라이머와 프로 브 설계를 위해 두 개의 타겟 유전자(invA, stn)가 선택되 었으며, 특이도와 민감도(검출한계)를 평가함으로 개발된 검출법을 검증하고자 하였다. 본 연구에서는 특이도 검증 을 위해 Salmonella 균주 42주와 Non-Salmonella 균주 21 주를 포함하였으며, 본 방법으로 Salmonella 42주에 대해 서만 정확하게 검출이 가능하였다. 검출한계는 살모넬라 genome DNA 기준으로 101 copies/μL 였으며, 소시지에서 는 4시간 증균 이후 접종균수로서 101CFU/g 에서 102 CFU/ g까지 검출이 가능하였다. 본 연구에서 개발된 검출법은 신속한 식중독 원인조사에 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

    Acknowledgement

    본 연구는 2014년도 식품의약품안전처 자체연구개발비 (14161예방안074)로 수행되었으며 이에 감사드립니다.

    Figure

    JFHS-33-50_F1.gif

    Sensitivity of the ultrafast real-time PCR amplication in detecting Salmonellastn gene. (A) Agarose gel electrophoresis of PCR amplicons of Salmonellastn gene. Lane M: 100 bp DNA ladder, Lane 1-6: 101 to 106 CFU/mL. (B) Ultrafast real-time PCR amplification of Salmonellastn gene.

    JFHS-33-50_F2.gif

    Sensitivity of the ultrafast real-time PCR amplication in detecting SalmonellainvA gene. (A) Agarose gel electrophoresis of PCR amplicons of SalmonellainvA gene. Lane M: 100 bp DNA ladder, Lane 1-6: 101 to 106 copies/μL. (B) Ultrafast real-time PCR amplification of SalmonellainvA gene.

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    Detection limits of Salmonella (A) stn gene and (B) invA gene using designed primer and probe.

    JFHS-33-50_F4.gif

    Detection limits of Salmonella enterotoxin ATCC 13076 (A) stn gene and (B) invA gene. ◆: Salmonella enterotoxin ATCC 13076 cells grown in broth, ■ : Artificially inoculated sausage samples after enrichment for 4 h.

    Table

    Inclusivity and exclusivity tests by two types of real-time PCR methods

    aATCC: American Type Culture Collection
    bNCCP: National Culture Collection for Pathogens
    cMFDS: Ministry of Food and Drug Safety
    dKCCM: Korean Culture Center of Microorganisms
    eKCTC: Korean Collection for Type Cultures
    fNA: Not available
    g+: positive test result, -: negative test result

    Sequences of primers and probes used for the Salmonella-specificity assay

    Reference

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