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ISSN : 1229-1153(Print)
ISSN : 2465-9223(Online)
Journal of Food Hygiene and Safety Vol.33 No.1 pp.58-64
DOI : https://doi.org/10.13103/JFHS.2018.33.1.58

Analytical Method for Determination of Cephalexin in Bovine Edible Tissues using Liquid Chromatography Coupled to Tandem Mass Spectrometry

Won-Seok Chae, Sung Joong Lee1, Song-Ee Son2, Suk Kim2, Hu-Jang Lee2*
Department of Chemistry, Daejin University, Pocheon, Korea
1Department of Chemistry and Research Institute of Live Science, Gyeongsang National University, Chinju, Korea
2Institute of Animal Medicine and College of Veterinary Medicine, Gyeongsang National University, Chinju, Korea
Correspondence to: Hu Jang Lee, College of Veterinary Medicine, Gyeongsang National University, Chinju 52828, Korea 82-55-772-2352, 82-55-772-2308hujang@gnu.ac.kr
20171111 20171203 20171216

Abstract

An analytical method for the determination of cephalexin (CEX) in bovine tissues (muscle, liver, kidney and fat tissues) was developed and validated using liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). Tissue samples were extracted by the liquid-liquid extraction based on 5% trichloroacetic acid (TCA). The chromatographic separation was achieved on a reverse phase C18 column with gradient elution using a mobile phase of 20 mM hexafluroacetylacetone (HFAC)/50% acetonitrile (40:60). The procedure was validated according to the Ministry of Food and Drug Safety guideline determining accuracy, precision, and limit of detection. Mean recoveries of CEX from spiked edible tissues (6~1,500 μg/kg) were 83.9~106.8%, and the relative standard deviation was between 2.3 and 14.8%. Linearities were obtained with the correlation coefficient (r2) of > 0.999. Limit of detection and limit of quantification for the investigated CEX were 2~10 and 6~30 μg/kg, respectively. This method was reliable, sensitive, economical and suitable for routine monitoring of CEX residues in bovine edible tissues.


LC-MS/MS를 이용한 소의 식용조직 중 세팔렉신의 잔류검사법

채 원석, 이 성중1, 손 송이2, 김 석2, 이 후장2*
대진대학교 자연과학대학 화학과
1경상대학교 화학과·생명과학연구원
2경상대학교 수의과대학·동물의학연구소

초록


    Daehan New Pharm Co.,Ltd

    많은 항생물질들이 가축의 질병예방과 치료를 목적으로 오랜 기간 동안 사용되어 왔다1). 이러한 항생물질들의 사 용에 의해, 미량의 항생물질 혹은 이들의 대사물질들이 축 산식품 중에 잔류할 가능성이 상존하고 있다. 미량 항생 물질들이 잔류한 축산식품을 지속적으로 섭취한다면 알레 르기 혹은 내성균의 출현 등과 같은 부작용을 야기함에 따라 인체의 건강을 위협하는 심각한 문제가 될 수 있다2,3).

    Cephalexin (CEX) (Table 1)은 강력한 cephalosporin계 항 생물질로서 그람 양성 및 그람 음성균에 대해 광범위하게 작용하는 것으로 알려져 있으며, 혈액단백질과의 약한 결 합능력, 낮은 독성, 경구투여 시 단기간 내 높은 혈장 및 요 농도 유지 그리고 대사물질이 존재하지 않는 등의 장 점이 있어 가축의 세균성 감염을 예방하고 치료하는데 광 범위하게 사용되고 있다4). CEX는 세균의 세포벽 내 peptidoglycan 층에 존재하는 아미노산인 D-alanyl-D-alanine 과 유사한 구조를 갖고 있어서, 세균 세포벽의 합성에 필 수적인 페니실린-결합 단백질의 활성부위에 비가역적으로 결합한다. 그 결과 peptidoglycan 층의 합성을 저해하여 세 균을 사멸시키는 것으로 알려져 있다5). 하지만, 몇몇 세균 들은 β-lactamase라는 효소를 갖고 있어서 β-lactam ring의 가수분해로 CEX를 비활성화시켜 CEX에 대한 내성을 획 득하는 것으로 알려져 있다6). CEX가 축산식품 내 잔류할 경우 인체에 심각한 부작용을 초래할 수 있어서, 세계 각 국에서는 CEX에 대해 축산식품 중 최대잔류허용기준을 설정하여 운용하고 있다. 우리나라를 포함하여 유럽연합 과 미국 등에서는, 소의 우유, 근육, 간장, 신장 그리고 지 방 등에 대한 CEX의 최대잔류허용기준을 각각 100, 200, 200, 1,000, 200 μg/kg으로 설정하고 있다7,8).

    다양한 시료에 대한 CEX 정량분석 방법들이 보고되고 있는데, 이들 방법들에는 spectrophotometry9), high performance thin layer chromatography10), molecular imprinted solid phase extraction11), high performance liquid chromatography 12,13), liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS)14-17) 그리고 ultra- high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry18) 등이 있다. 이 들 분석법들 중 몇몇 분석방법들은 추출시간11)과 chromatography 분석시간이 길거나19), 낮은 회수율20)을 보이는 것 이 단점으로 보고되고 있다. 또한, 일부 분석법들은 약리 학적 용량 제형9,10) 혹은 우유13)에서 CEX를 분석하기 위 해 개발되었거나, 고도로 숙련된 분석기술자만이 다룰 수 있는 장비를 필요로 하는 것으로 알려져 있다20).

    따라서 본 연구에서는 소의 근육, 간장, 신장 및 지방 조직에서 기존 분석법보다 신속하고 정확하게 CEX를 분 석할 수 있는 분석법을 개발하여 국내 생산 및 수입 축산 물에 대한 안전관리 강화에 기여하고자 한다.

    Materials and Methods

    시약 및 재료

    CEX (≥ 98.0%)와 tobramycin (≥ 98.0%) 표준품은 Sigma- Aldrich (St. Louis, MO, USA)사로부터 구입하여 사용하 였다. 전처리 시약으로 사용된 삼염화초산(trichloroacetic acid, TCA), 메탄올, heptafluorobutyric acid (HFBA, ≥ 99.5%) 등은 Merck (Darmstadt, Hesse, Germany)사에서 HPLC 등 급으로 구입하여 사용하였고, 이외의 분석용 시약 및 용 매는 특급 또는 분석용을 사용하였다. 또한, 고상추출(solid phase extraction, SPE)용 카트리지는 HyperSep 카트리지 (C18, 6 mL, 500 mg)를 Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)사로부터 구입하여 사용하였다. 시험용 시료는 3주 동안 CEX가 함유된 동물용의약품을 처치하지 않은 육우를 도축장에서 도축하여 근육, 간, 신장, 지방 조직 등 을 채취하여 분석 전까지 냉동고(−20°C)에 보관하면서, 공 시료(blank) 시험을 거쳐 CEX가 잔류되지 않음을 확인한 후 시험용 시료로 사용하였다.

    표준원액 및 표준용액의 조제

    CEX와 tobromycin 표준품 1.0 g을 각각 저울로 정밀히 달아 1,000 mL 정량플라스크에 넣고, 증류수를 사용하여 1 mg/mL이 되도록 표준원액을 각각 조제하였다. 조제한 tobramycin의 표준원액은 메탄올을 사용하여 단계적으로 희석하여 농도가 1 μg/mL이 되도록 하였다. 또한, 조제한 CEX 표준원액은 증류수를 사용하여 단계적으로 희석하여 각각의 조직시료에 대한 표준곡선을 작성하는데 사용하였 다. 조제한 CEX 표준원액은 증류수를 사용하여 단계적으 로 희석하여, 근육은 6, 12, 24, 60, 120, 600 ng/mL의 표 준용액을 각각 준비하였고, 간은 3, 6, 12, 30, 60, 300 ng/ mL의 표준용액을 각각 준비하였으며, 신장은 7.5, 15, 30, 75, 150, 750 ng/mL의 표준용액을 각각 준비하였고, 지방 조직은 6, 12, 24, 60, 120, 600 ng/mL의 표준용액을 각각 준비하였다. Tobramycin 표준용액(1.0 μg/mL)과 각각의 표 준용액은 갈색 유리병에 담아 4°C 냉장실에 보관하면서 실험 직전에 꺼내어 사용하였다.

    추출 및 정제

    균질기를 이용하여 분쇄한 조직시료 각 2 g과 50 μL의 내부표준물질인 tobramycin (1.0 μg/mL)을 50 mL falcon tube에 넣고, 10 mL의 5% TCA를 가한 다음 1분 동안 vortex mixer를 이용하여 혼합해 주었다. 이어서 4,000 rpm, 8°C 조건에서 10분 동안 원심분리시킨 후 상층액을 분리 하였다. 상층액을 분리하고 남은 잔액은 위와 같은 방법 을 반복 시행하여 다시 얻은 상층액을 앞서 얻은 상층액 과 혼합한 다음, Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)사 로부터 구입한 거름종이(Whatman filter paper No. 1)로 여 과하였다. 진공분리장치와 연결된 SPE 카트리지를 5 mL 의 메탄올과 물로 각각 활성화시킨 다음 앞서 거름종이로 거른 여액 2 mL을 적하한 후 0.5 mL/min의 속도로 흘려 주면서 추출하였다. 여액이 SPE 카트리지를 모두 통과한 후 다시 SPE 카트리지에 2 mL의 메탄올과 2 mL의 25 mM 구연산을 적하하여 잔류여액을 씻어내고 진공을 이용하여 완전히 제거한 다음, 3 mL의 메탄올에 HCl을 넣어 0.1% 로 만든 용액을 이용하여 SPE 카트리지로부터 분석물질 들을 용출시켰다. 용출액을 40°C heating block 위에서 질 소가스를 이용하여 건조·증발시킨 다음 잔유물을 1 mL 의 5 mM HFBA로 녹이고 Nylon 0.2 μm membrane filter (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)로 여과하여 유리 vial 에 담아 분석용액으로 사용하였다.

    기기분석조건

    식품공전 중 잔류동물용의약품시험법의 정량시험법21)을 변형하여, CEX의 분석을 위한 기기분석조건을 다음과 같 이 확립하였다. 육우의 근육, 간, 신장, 지방 조직 등에 대 한 CEX의 분석에는 LC-MS/MS 검출기로 AB SCIEX (Concord, ON, Canada)사의 API 4000을, column은 Waters (Milford, MA, USA)사의 XTerra MS C18(3.0 × 50 mm, 5 μm)을 각각 사용하였으며 분석조건은 Table 2에 나타내 었다. Column 온도는 30°C를 유지하였다. 또한, 이동상 용 매 A는 증류수에 HFAC를 용해시켜 20 mM 농도로 조제 한 용매를 사용하였으며, 이동상 용매 B는 50% 아세토니 트릴을 사용하였다. 분석 시, 이동상 용매 A와 B는 각각 40%와 60%로 하여 분석기간 동안 계속 흘려 보내주었다. Chromatography의 총 분석시간은 3분으로 하였으며, 표준 용액을 positive ion mode로 Declustering Potential (DP), Collision Energy (CE), Collision cell Exit Potential (CXP) 등 LC-MS/MS의 MS 각각의 parameter를 최적화한 multiple reaction monitoring (MRM) 조건을 확립하여 분석에 사용 하였다.

    분석법 검증

    앞서 준비한 각각의 표준용액을 이용하여 검량곡선을 작 성한 후 표준곡선의 직선성을 확인하기 위해 상관계수 (coefficient of correlation, r2)를 구하였다. 검출한계(limit of detection, LOD) 및 정량한계(limit of quantification, LOQ)는 chromatogram 상에서 신호 대 잡음비(signal to noise ratio, S/N ratio)의 각각 3배와 10배 농도로 산출하 였다22). 회수율 측정은 CEX가 들어있지 않음을 확인한 공 시료에 CEX를 첨가하여 최종농도가 근육의 경우에는 12, 60, 600 ng/mL이 되도록 하였고, 간의 경우에는 6, 30, 300 ng/mL이 되도록 하였고, 신장의 경우에는 15, 75, 750 ng/mL이 되도록 하였으며, 지방조직의 경우에는 30, 150, 1,500 ng/mL이 되도록 하여, 앞서의 ‘추출 및 정제’ 방법 에 따라 3 반복 실험하였다. CEX 표준품의 peak 면적에 대한 추출한 시료들의 peak 면적비로부터 CEX의 회수율 (%)을 구하였다. 또한, 회수율의 정밀성을 검증하기 위해, 3 반복 회수율로부터 상대표준편차를 구하였다. 측정된 정 량한계, 회수율 그리고 상대표준편차의 적정성은 잔류동 물용의약품 분석법 실무 해설서23)에서 분석법 검증에 요 구되는 기준인 잔류허용기준의 1/2의 정량한계, 60~120% 의 회수율 그리고 20~30%의 상대표준편차 이하로 판단하 였다.

    Results

    LC-MS/MS

    HPLC를 통과하여 질량분석기에서 검출된 CEX의 머무 름 시간은 근육, 간, 신장, 지방조직에서 각각 1.34, 1.31, 1.30, 1.31분이었으며, chromatography의 총 분석시간은 3 분으로 나타났다. 본 연구에서 확립한 CEX 분석을 위한 LC-MS/MS는 정성 및 정량의 선택성과 검출감도를 향상 시키기 위하여 MS/MS 분석 시 MRM 모드로 분석하였으 며, 충돌 에너지의 강도를 조절함으로써 생성이온(product ion)의 감응도가 크도록 조정하였다. 또한, 최적의 선구이 온(precursor ion)과 생성이온을 각각 선정하였다. 각각의 조직들에 CEX를 LOQ 농도로 spike하여 분석한 CEX의 chromatogram을 Fig. 1에 나타내었다. 양이온 모드에서 [M+H]+인 m/z 348이 기준이온(base ion)으로 검출되어 이 를 선구이온(precursor ion)으로 선택 하였으며, product ion scan을 통하여 m/z 158과 106 이온이 특성 이온으로 나타 나 이들을 정성이온으로 선정하였다.

    분석법의 LOD 및 LOQ

    본 시험방법에 따른 분석기기의 LOD 및 LOQ는 각 시 료 별로 Table 3에 나타내었다. 근육, 간, 신장, 지방조직 에 대한 LOD는 각각 4, 2, 5, 10 μg/kg이었으며, LOQ는 각각 12, 6, 15, 30 μg/kg으로 나타났다.

    표준곡선, 회수율 및 정밀성

    각각의 시료들에 대해 CEX 표준용액을 6개의 서로 다 른 농도로 희석하여 LC-MS/MS로 분석한 후 표준곡선의 직선성을 확인한 결과, 근육, 간, 신장, 지방조직의 상관계 수가 각각 0.9993, 0.9997, 0.9995, 0.9992로 양호한 직선 성을 나타내었다(Fig. 2). Table 3은 CEX의 정량분석을 위 해 각각의 시료에 여러 농도로 CEX의 표준용액을 첨가한 후 ‘추출 및 정제’ 방법과 기기조건으로 3회 반복 분석 후 회수율과 정밀성을 측정한 결과를 나타낸 것이다. 근육, 간, 신장, 지방조직에서, 회수율의 범위는 각각 90.0~99.5%, 83.9~106.8%, 89.6~101.3%, 94.4~96.1%로 나타났으며, 상 대표준편차의 범위는 각각 2.3~6.6%, 2.6~14.8%, 3.4~14.0%, 2.7~3.2%로 나타났다.

    Discussion

    2015년도 국가 항생제 사용 및 내성 모니터링 자료에 따르면24), 2015년 항생제 종류별 판매량은 tetracycline계 (237톤)와 penicillin계(223톤) 항생제가 가장 많이 판매되 었으며, 대부분의 항생제 판매량은 감소 추세를 나타내었 지만 cephalosporin계 항생제 판매량은 점차 증가하여 2007 년에 비해 5배 증가한 것으로 조사되었다. 또한, CEX는 cephalosporin계 항생제 중 ceftiofur 다음으로 가장 많이 판매된 것으로 나타났다. 경남 지역에서 살모넬라성 설사 에 걸린 송아지의 분변으로부터 분리한 Salmonella spp. 23주에 대해 항생제 내성 검사를 실시한 결과, CEX는 95.6% 의 내성을 보였고, penicillin, oxytetracycline, tetracycline 등 은 100% 내성을 나타내었다고 보고하였다25). 이는 CEX 가 농가에서 빈번하게 사용되고 있어서, 소의 식용조직에 잔류할 가능성이 높다는 것을 의미한다.

    CEX가 속한 β-lactam계 항생제는 3개의 탄소 원자와 1 개의 질소 원자로 이루어진 이종원자 환형 고리 구조를 갖고 있으며, 이러한 4환 고리 구조는 안정성이 낮아 화 학적으로 반응하기 용이하다. 따라서 다른 효소들과 반응 하여 고리가 분해되어 원래의 구조대로 존재하는 경우가 드물기 때문에 이들 항생제의 잔류량을 파악하기 위해 신 속하고 정확한 분석방법이 요구된다26).

    앞선 연구에서, LC-MS/MS를 이용해 소 근육 중에서 CEX를 포함한 cephalosporin계 항생제들에 대한 분석법을 확립한 결과, CEX의 머무름 시간은 3.94분이었으며, chromatography의 총 run time은 9분이었다고 보고하였다17). 또한, 유통 식육 중에 cephalosporin계 항생제들을 검출하기 위 해 확립한 LC-MS/MS법에서, CEX의 머무름 시간은 3.15 분이었으며, chromatography의 총 분석시간은 10분이었다 고 보고하였다14). 한편, 우유 중에서 cephalosporin계 항생 제들을 검출하기 위해 확립한 LC-MS/MS법에서, CEX의 머무름 시간은 1.05분이었으며, chromatography의 총 분석 시간은 3분이었다고 보고하였다16). 앞선 연구 결과들로부 터, 본 연구를 통해 확립된 LC-MS/MS법의 축산물에 대 한 CEX의 분석시간은 Pérez-Burgos 등17)의 연구와 Kim 등14)의 연구를 통해 확립된 LC-MS/MS법보다는 3배 이상 빠른 것으로 나타났으며, Liu 등16)의 연구에서 확립한 LCMS/ MS법과는 같았던 것으로 나타났다.

    소의 근육 중 CEX를 LC-MS/MS로 분석한 앞선 연구 결과, LOD와 LOQ는 각각 5와 10 μg/kg이었다고 보고하 였다17). 또한, 시판 중인 식육 중에서 cephalosporin계 항 생물질을 LC-MS/M로 분석한 연구에서, CEX의 LOD와 LOQ는 각각 6.9와 20.9 μg/kg이었다고 보고하였다14). 한편, 식육 중에서 여러 계열의 항생제를 동시에 분석할 수 있 는 LC-MS/MS법을 확립한 연구에서, CEX의 LOD와 LOQ 는 각각 15와 50 μg/kg이었다고 보고하였다27). 앞선 연구 들과 비교하여, 본 연구에서 확립한 분석법의 소 근육 중 CEX의 LOD는 가장 낮은 것으로 나타났으며, LOQ는 Kim 등14)과 Carretero 등27)의 연구결과보다는 낮았으며, Pérez- Burgos 등17)의 연구결과와는 같은 것으로 나타났다. 한편, 식품공전 중 식품 중 동물용의약품의 잔류허용기준21)과 유 럽의약품청의 기준28)에 따르면, 소의 우유, 근육, 간장, 신장 그리고 지방 등에 대한 CEX의 최대잔류허용기준은 각각 100, 200, 200, 1,000, 200 μg/kg으로 설정하고 있어서, 본 연구에서 확립한 분석법은 소의 우유, 근육, 간장, 신장, 지방조직 중의 최대잔류허용기준 이하로 CEX의 잔류를 분석하는 것이 가능한 것으로 확인되었다. 또한, 식품의약 품안전처의 잔류동물용의약품 분석법 실무 해설서의 식품 에 대한 잔류동물용의약품 분석법 기준에 따르면, 잔류허 용기준이 50 ng/mL 이하인 경우, LOD는 잔류허용기준의 1/2 이하이어야 하며, LOQ는 10 ng/mL 이하이어야 한다 고 규정하고 있다23). 따라서 본 연구에서 확립한 LC-MS/ MS법의 경우, 소의 가식부위(근육, 간, 신장, 지방)에 대 한 LOD와 LOQ의 범위는 각각 2~10과 6~30 μg/kg으로 나타나, 잔류동물용의약품 분석법 실무 해설서23)의 분석법 기준을 충족하고 있는 것으로 나타났다.

    선행연구에서, CEX 표준곡선의 직선성과 회수율을 확 인한 결과, r2는 0.982이었으며, 회수율은 65%이었다고 보 고하였다17). 또한, 돈육에서 22종의 cephalosporin계 항생 제 동시분석을 위한 LC-MS/MS법을 확립한 연구에서, CEX 의 r2는 약 0.997이었으며, 회수율의 범위는 86.8~96.3%이 었다고 보고하였다15). 한편, 식육 중에서 여러 계열의 항 생제를 LC-MS/MS를 이용해 다중 분석한 연구에서, 우육 과 돈육에서 CEX의 r2는 각각 0.999와 0.997이었으며, 회 수율의 범위는 74~82%이었다고 보고하였다27). 본 연구에 서 확립한 LC-MS/MS법의 경우, 소의 가식부위에서의 CEX 의 r2는 모두 0.999 이상이었으며, 소의 근육에서 CEX의 회수율 범위는 90~99.5%를 나타나, 앞선 연구들과 비교하 여 높은 직선성과 회수율을 나타내었으며, CODEX29,30)에서 설정한, r2 ≥ 0.95와 회수율 80~110%를 모두 충족하였다.

    이상의 연구결과로부터, 본 연구에서 LC-MS/MS를 이 용하여 확립한 소의 식용조직에서 CEX의 정량분석법은 잔류동물용의약품 분석법 실무해설서23)의 검증기준을 모 두 충족하는 것으로 나타났다. 또한, 기존 시험법에 비해 높은 회수율, 정밀성, 검출감도 그리고 빠른 분석시간을 갖고 있어서, 축산식품 중에 CEX의 신속한 분석이 가능 할 것으로 사료된다.

    국문요약

    본 연구는 소의 가식부위(근육, 신장, 간장, 지방) 중에 서 세팔렉신을 효과적으로 정량분석하기 위한 LC-MS/MS 법을 확립하고 이를 검증하기 위해 수행되었다. 확립된 LC-MS/MS에 대해 특이성, 검출한계, 정량한계, 정확도 및 정밀도에 대한 검증을 통하여 유효성을 확인하였다. 표준 용액을 이용하여 검량성을 작성한 결과, r2 > 0.999 이상의 직선성을 나타내었으며, 세팔렉신에 대한 검출한계와 정 량한계는 각각 2~10과 6~30 μg/fkg으로 나타났다. 또한, 회 수율은 83.9~106.8%로 나타났으며, 상대표준편차는 2.3~ 14.8%로 나타나 정확성이 우수하였다. 이는 식품의약품안 전처의 잔류동물용의약품 분석법에서 제시한 기준에 모두 적합한 수준이었다. 따라서 본 연구를 통해 개발된 LCMS/ MS법은 향후 소의 가식부위 중 세팔렉신을 분석하는 데 효과적으로 활용될 수 있을 것으로 사료된다.

    Acknowledgement

    본 논문은 (주) 대한뉴팜(서울)의 지원에 의해 이루어진 것입니다.

    Figure

    JFHS-33-58_F1.gif

    LC-MS/MS chromatogram (MRM mode) of spiked bovine tissue samples at the limit of quantification of cephalexin. TIC, total ion chromatogram; CEX, cephalexin; IS, internal standard (tobramycin). (A) muscle spiked with 12 ng/g of CEX, (B) liver spiked with 6 ng/g of CEX, (C) kidney spiked with 15 ng/g, (D) fat tissue spiked with 30 ng/g of CEX.

    JFHS-33-58_F2.gif

    Standard calibration curves, linearities and correlation coefficients (r2) of cephalexin in bovine tissues. CEX, cephalexin; IS, internal standard (tobramycin). (A) muscle, (B) liver, (C) kidney, (D) fat tissue.

    Table

    Molecular structure and physico-chemical properties of cephalexin

    Multiple reaction monitoring condition of cephalexinc

    CEX, cephalexin; TBM (IS), tobramycin (internal standard); DP, declustering, potential (volts); CE, collision energy (volts); CXP, collision cell exit potential (volts).

    Recoveries, relative standard deviations (RSD), limit of detection (LOD) and limit of quantification (LOQ) of CEX from bovine tissues by LC-MS/MS

    Recovery and RSD, mean of 3 replicate studies.

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