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ISSN : 1229-1153(Print)
ISSN : 2465-9223(Online)
Journal of Food Hygiene and Safety Vol.33 No.1 pp.65-70
DOI : https://doi.org/10.13103/JFHS.2018.33.1.65

Comparison of Growth Rates of Listeria Interspecies in Different Enrichment Broth

Da Yeon Lee, Yong Sun Cho1*
Samsung Biologics Co., Quality Control Team, Incheon, Korea
1Korea Food Research Institute, Food Analysis Center, Jeollabuk-do, Korea
Correspondence to: Yong Sun Cho, Korea Food Research Institute, Food Analysis Center, 245, Nongsaengmyeong-ro, Iseo-myeon, Wanju-gun, Jeollabuk-do 55365, Korea 82-63-219-9242, 82-63-219-9280yscho@kfri.re.kr
20170831 20170926 20171221

Abstract

Monitoring of Listeria monocytogenes, the causative agent of listeriosis, in food is inportant for public health. The Korean Food Standards Codex has adopted a ‘zero-tolerance’ policy for L. monocytogenes. The standard detection method of L. monocytogenes is based on enrichment. Thus, proper enrichment methods need to be instituted to ensure quality control of the detection procedures. In this study, the growth of L. monocytogenes and Listeria innocua as a mixed culture in Listeria enrichment broth (LEB) was monitored during artificial contamination of enrichment culture. We confirmed competitive growth or interspecies inhibitory activity of L. monocytogenes and L. innocua. Interspecies growth differences and the inhibitory activity of different inoculation and mixtures L. innocua against L. monocytogenes were examined. The concentration of L. monocytogenes must be 2.0 log CFU/mL or more than L. innocua to grow better than L. innocua. It is known that Listeria spp. and L. monocytogenes show growth difference during LEB, resulting in the risk of false-negative results. The inhibition of L. monocytogenes by L. innocua was always observed when present at lower concentrations. However, it was confirmed that L. innocua suppressed when L. monocytogenes was present at a higher concentration. Therefore if a mixture of Listeria spp. is present, detecting L. monocytogenes is difficult. Thus, a new enrichment broth to improve the detection rate of L. monocytogenes is needed.


증균배지에서의 Listeria Interspecies의 경쟁생육 비교

이 다연, 조 용선1*
삼성바이오로직스 품질관리팀
1한국식품연구원 식품분석센터

초록


    Ministry of Science, ICT and Future Planning
    E0152202-02

    Listeria monocytogenes는 통성혐기성 gram 양성 무아포 단간균으로 30% 이상의 높은 치사율을 보이는 인수공통 감염병 Listeriosis를 유발하기 때문에 임상적으로 중요한 위해균으로 분류된다1-3). 최소 감염량은 면역력이 약한 위 험군 혹은 식품별로 차이가 있으나 일반적으로 102~103 CFU/g로 제시되고 있어 낮은 오염수준에서도 식중독이 발 생할 수 있고, 특히 면역력이 약한 임산부에게 치명적인 균이다2,4). 토양, 물 등 자연환경에 흔히 존재하고 열, 염 기, 산, 염에 강하여 식품에 쉽게 오염되며 최적 생육온도 는 30~37°C이지만 0~4°C 냉장온도에서도 생육하는 저온 균으로4,5) 국내에서 높은 소비량을 유지하고 있는 육류가 공품, 치즈, 우유, 훈제연어, 채소류에서 주로 검출되기 때 문에 이에 대한 관리가 중요하다2,3). 따라서 국내 식품의 약품안전처를 비롯하여 World Health Organization (WHO) 와 Food and Drug Administration (FDA) 등 여러 기관은 L. monocytogenes의 관리기준을 불검출로 설정하여 엄격 한 수준으로 관리하고 있다6).

    L. monocytogenes의 검출방법은 증균배양을 이용한 culture-based 검출법, PCR 검출법, ELISA 검출법, DNA microarray, LAMP 검출법 등이 있지만7), 일반 산업체에서 PCR, ELISA 등으로 검출하기에는 분석 비용, 기술력 부 족 등으로 어려움이 있으며, 결과 확인을 위해 순수한 분 리주를 분리 후 동정해야 하기 때문에 증균배양 시험법을 선호하고 있다. 또한, 식품공전에는 culture-based 검출법 이 등재되어 있으므로8) 품질관리시 증균배양은 필수 불가 결하다. 하지만 증균배양을 이용한 검출법은 L. monocytogenes의 초기 균수와 기타 오염균, 배지 성분 등에 영 향을 받는다7,9). 특히, 현재 사용되는 증균배지는 Listeria 속을 증균하는 조성이므로 여러 종이 혼합오염 된 경우 L. monocytogenes 검출을 방해 할 수 있으며9)L. monocytogenes를 선택적으로 증균하기 위해 첨가한 인자가 경 쟁관계에 있는 다른 Listeria 속의 생육을 돕는 인자로 작 용한다는 보고가 있다9,10). 식품에는 다양한 Listeria 속이 오염될 수 있으며 생화학적, 유전학적 특성이 매우 비슷 하기 때문에 이들을 구분하기가 쉽지 않다1,11). 따라서 Listeria 종 간의 과성장 및 경쟁에 의해서 L. monocytogenes 를 검출 시 L. monocytogenes가 존재하더라도 불검출 되 는 ‘위음성’의 가능성이 있다6,12).

    국내 식품공전은 L. monocytogenes 증균을 위한 1차 배 지로 Listeria Enrichment Broth (LEB)를 규정하고 있다. 문헌 조사에 의하면 Tryptic Soy Broth (TSB), Fraser broth 의 영양배지나 2차 증균배지에서의 Listeria 종 간의 생육 에 대한 연구결과가 보고되어있으나6,10,12) 국내 식품공전에 서 규정된 LEB 배지에서의 Listeria 종 간의 생육 연구는 보고된 바 없다. 따라서 국내 식품에서 주로 검출되는 Listeria 속 4종(L. monocytogenes, L. innocua, L. ivanovii, L. seeligeri)을 선정하여 LEB에 혼합 배양하고 생육을 확 인하여 현재 검출법의 적합성을 확인해보고자 하였다.

    Materials and Methods

    표준균주

    본 시험에 사용된 균주는 L. monocytogenes (ATCC 15313), L. innocua (ATCC 33090), L. ivanovii (ATCC 19119), L. seeligeri (ATCC 35967)로 American type culture collection (ATCC, Manassas, VA, USA)에서 분양 받아 사용하였다. 사용 균주는 30% glycerol stock vial에 현탁 후 −70°C deep freezer에 냉동 보관하였으며, 필요 시 tryptic soy agar (TSA; Merck., Darmstadt, Germany)에 0.6% yeast extract (YE; Becton-Dickinson., Erembodegem, Belgium) 포함한 배지에 35 ± 2°C, 24 ± 2시간, 3회에 걸쳐 계대 배양 하여 활성화 시킨 후 사용하였다.

    Listeria 속 4종 혼합배양액 생육측정

    Listeria species 4종 혼합 배양 시 각 균의 생육을 확인 하기 위해 TSA+YE 0.6% 배지에서 35 ± 2°C, 24 ± 2시간 활성화 시킨 L. monocytogenes, L. innocua, L. ivanovii, L. seeligeri를 McFarland 1.0로 맞춘 후 희석하고 동량 혼합 하여 시험액을 제조하였다. LEB (Merck., Darmstadt, Germany) 에 초기 균수가 100 CFU/mL 이 되도록 시험액을 접종하였다. 균주를 접종한 배지는 35 ± 2°C, 70 rpm 진탕 배양하면서 시간에 따른 각 균의 생육을 real-time PCR System (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA)로 확인 하였다. 4종의 균을 단독 배양한 것을 대조구로 하였다. 같은 방법으로 L. monocytogenesL. innocua (또는 L. ivanovii, L. seeligeri)을 1:1로 혼합한 2종 혼합배양액의 생 육도 확인하였다.

    Real-time PCR 분석을 위한 DNA 추출

    4종의 Listeria 균주를 200 μL를 HiYieldTM Genomic DNA Mini Kit (RBC Bioscience Co., Taipei, Taiwan)를 사용하여 추출하였다. 추출방법은 매뉴얼에 따라 proteinase K 30 μL를 처리하고, 60°C, 15분 배양 후 GB buffer 200 μL 혼합하여 70°C에서 15분 배양하여 cell lysis를 하 고 ethanol 처리 후 GB column으로 옮겨 원심 분리하여 DNA를 binding시키고 wash buffer로 세척하였다. 70°C에 서 15분 동안 pre-heating한 elution buffer로 DNA를 추출 하였다.

    Real-time PCR 분석

    PCR mixture는 template DNA 2 μL, taqman fast advanced master mix (Applied biosystems) 10.0 μL에 L. monocytogenes, L. ivanoviiL. seeligeri, L. innocua 각 primer를 0.2 μL, taqman probe 0.2 μL를 넣고 nuclease-free water 6.8 μL로 하여 전체 20 μL로 하여 ABI 7500 (Applied biosystems)을 사용하여 2종씩(1set: L. monocytogenes, L. innocua, 2set: L. monocytogenes, L. ivanovii, 3set: L. monocytogenes, L. seeligeri) duplex real-time PCR을 수행하였 다. PCR primer는 Table 1과 같으며 50°C, 2분, 95°C, 20 초 hold 후 denature 95°C, 2초, anneal/extend 60°C, 30초 과정을 40 cycle 반복하였다. 정량 분석을 위해 표준 균주 에 대한 standard curve는 PCR 3회 반복의 각 시료에 대 한 Ct 평균값 ±표준편차 값으로 작성 후 회귀분석을 통해 계산식을 산출하였다. 증폭 효율성(amplification efficiency, AE)은 AE = 10−1/s−1 (s: slope of standard curve)으로 산출 하였다. 각 균은 35 ng DNA를 양성 대조구로 nucleasefree water를 음성 대조구로 사용하였다.

    L. monocytogenesL. innocua 초기 균수 비율에 따 른 비교

    TSA+YE 0.6% 배지에서 35 ± 2°C, 24 ± 2시간 활성화 시 킨 L. monocytogenesL. innocua를 McFarland 1.0 로 맞 춘 후 희석하고 초기 균수를 비율 별 혼합하여 시험액을 제조하였다. 각 시험액의 균의 비율은 L. monocytogenes: L. innocua (1:1, 2:1, 10:1, 100:1)로 제조하였고, LEB에 초기 균수가 100 CFU/mL이 되도록 접종하였다. 35 ± 2°C, 70 rpm 진탕 배양하면서 0, 24, 48시간에 Agosti & Ottaviani Listeria Agar (ALOA; Biomériux, Marcy L’Etoile, France) 에 도말하고 35 ± 2°C에서 24시간 배양하여 각 균의 전형 적인 집락을 계수하였다. 결과값은 log값으로 변환하여 분 석하였으며 2종의 균을 단독 배양한 것을 대조구로 하였다.

    Results and Discussion

    Listeria 속 4종 혼합배양액 생육측정

    Listeria 속 4종 혼합 배양 시 각 균의 생육을 확인한 결 과 L. innocua의 균수가 가장 최고치에 도달한 21시간에서 단독배양액 대비 혼합배양액에서 97.95% 생육하여 거의 동일하였던 반면, L. monocytogenes는 24시간에 87.86%, L. ivanovii, L. seeligeri는 48시간에 28.06%, 25.13%로 단 독배양액에 비해 혼합배양액에서의 생육이 저해되었다. 따 라서 Listeria 종 간의 혼합 배양 시 생육차이가 존재하는 것을 알 수 있었다(Fig. 1).

    본 연구과제에서 검출을 목적으로 하는 균이 L. monocytogenes이므로 이를 기준으로 각 균이 L. monocytogenes 의 생육에 어떤 영향을 미치는 지 확인해 본 결과 Fig. 2 와 같다. Panel A는 L. monocytogenesL. innocua를 혼합 배양한 배양액에서의 L. monocytogenes 생육과 L. monocytogenes 단독배양액에서의 L. monocytogenes 생육을 확 인한 결과로 단독배양액에 비해 혼합배양액에서의 L. monocytogenes의 생육이 24시간부터 1.46 log CFU/mL 저 해된 것을 확인하였다. 반면, panel B와 C는 단독배양액 과 혼합배양액에서의 L. monocytogenes의 생육이 동일하 여 차이가 없었다. Panel D에서는 단독배양액에 비해 혼 합배양액에서의 L. monocytogenes의 생육이 24시간부터 1.24 log CFU/mL 저해된 것을 확인하였다. 따라서 L. innocua에 의해서 L. monocytogenes가 생육이 저해 되었 다(Panel. A, D). 이는 Listeria 종 간의 혼합 배양 시 생 육의 차이가 있다는 보고와 일치하였다6,10,12-15). 반면, L. ivanovii, L. seeligeriL. monocytogenes의 생육에 영향을 주지 않는다는 것을 알 수 있었다. L. innocua의 생육은 L. monocytogenes, L. ivanovii, L. seeligeri의 영향을 받지 않으며 L. ivanovii, L. seeligeriL. monocytogenesL. innocua에 의해 생육이 저해된 결과를 얻었다.

    L. monocytogenesL. innocua 초기 균수 비율에 따른 비교

    L. monocytogenesL. innocua의 초기 오염 비율이 생 육에 영향을 미치는 정도를 확인하기 위해 초기 접종량을 비율별로 조절하여 배양해 보았다. 배양 결과에 사용한 ALOA 선택배지는 L. monocytogenes는 β-glucosidase 활성 에 의해 녹색 집락이 형성되며 phospholipase활성에 의해 집락주변에 opaque white halo가 형성되며, L. innocua는 녹색 집락이 형성되지만 opaque white halo는 나타나지 않 아 육안으로 구분이 가능하다3,5). 2균을 단독 배양한 결과 는 접종량에 따른 두 균의 생육은 동일하였다. 그러나 2 균을 동량 접종하여 혼합 배양한 결과 L. monocytogenesL. innocua의 차이는 24시간에 1.9 log CFU/mL, 48시 간에 1.5 log CFU/mL으로 L. monocytogenesL. innocua 에 비해 1.0 CFU/mL 이상 적게 생육하였다. L. monocytogenes의 초기 접종량이 L. innocua보다 2배(0.3 log CFU/ mL) 이상 오염된 경우 L. monocytogenesL. innocua에 24시간에 1.7 log CFU/mL, 48시간에 1.2 log CFU/mL 적게 생육하였고, 10배(1.0 log CFU/mL) 이상 오염된 경우도 마 찬가지로 24시간에 0.9 log CFU/mL, 48시간에 0.7 log CFU/ mL 적게 생육하였다. 100배(2.0 log CFU/mL) 이상 오염 된 경우에는 L. monocytogenesL. innocua보다 24시간 에 0.4 log CFU/mL 많이 생육하였지만 48시간에 균수는 동일하였다(Fig. 3, Table 2). 그러나 식품에서 L. monocytogenes가 보다는 다른 Listeria spp.에 의한 오염이 많이 되 어 있으므로17) 두 균주의 혼합오염이 있을 경우 현재 검출 법으로는 L. monocytogenes가 검출되기 어려워 검출률이 낮아질 것으로 생각된다. 이와 같은 결과는 L. monocytogenes가 존재함에도 불구하고 L. innocua의 성장이 빨 라서 불검출로 판정이 된 식품이 시중에 유통 될 경우 식 중독을 일으킬 수 있다고 판단된다. 따라서, 본 연구에서 는 현재 국내 식품 관리 기준 규격으로 설정 된 LEB 배 지에서 L. monocytogenes를 검출하는데 한계가 있음을 확 인하였다. Dahshan 등1)에 따르면 L. innocua를 28.5%, L. monocytogenes를 1.0%, Jamali 등16)L. innocua를 57.8%, L. monocytogenes를 21.7% 검출하였는데, L. innocua에 비 해 L. monocytogenes의 prevalence가 매우 낮은 것을 볼 수 있다. 이는 L. monocytogenes의 오염이 실제로 적을 수 도 있지만 L. innocua에 의해 생육이 저해되어 검출되지 않을 가능성도 예상된다. 선행연구에 따르면 생육저해의 원인은 growth rate의 차이 때문에 L. innocua가 우위를 형 성하기 때문이거나10,14), monocins, listeriocins, bacteriophage 와 같은 bacteriocin-like agent이 생산된 결과라는 보고15), 또는 일정수준의 균이 증식하면 신호를 보내 다른 균이 더 이상 증식하지 못하게 하는 quorum sensing 때문이라 는 등 다양한 발표가 있지만 현재까지 정확한 이유는 알 려져 있지 않다6,12).

    따라서 향후 Listeria interspecies 간의 생육의 차이의 원 인을 규명할 필요가 있으며, L. monocytogenes의 검출률을 높이기 위해 L. monocytogenes만을 선택적으로 증균할 수 있는 새로운 증균배지의 개발이 필요하다고 생각된다. 또 한 L. monocytogenes 검사 시 배양시간을 반드시 지켜야 하며 L. innocua가 검출되었을 때는 반복 실험을 통해서 L. monocytogenes 검사를 비교 분석하여야 한다. 본 연구 는 결과는 L. monocytogenes 검출률을 높여 국내 식품의 식품 안전에 기여 할 수 있으며 국내 식품 관리 규격 개 정 시 기초가 되는 참고 자료로 활용 할 수 있을 것으로 생각된다.

    국문요약

    L. monocytogenes는 Listeriosis를 일으키는 중요한 식중 독 균으로 현재 국내 식품공전에서는 증균배양을 기초로 검출하며, 규격은 불검출로 관리하고 있다. 그러나 Listeria 종 간의 혼합오염시 증균 과정에서 경쟁생육이 존재하여 L. monocytogenes 위음성의 가능성이 있다고 보고되고 있 다. 국내 식품공전은 L. monocytogenes 증균을 위한 1차 배지로 규정되어 있으나 LEB 배지에서의 Listeria 종 간의 생육 연구는 보고된 바 없다. 본 연구는 식품에서 주로 검 출되는 Listeria 속 4종(L. monocytogenes, L. innocua, L. ivanovii, L. seeligeri)을 LEB배지에 혼합배양하며 증균과 정에서 생육의 차이가 존재하는 것을 확인하였다. 특히, L. innocua에 의해 L. monocytogenes의 생육이 저해되며, L monocytogenes가 L. innocua보다 초기균수가 2.0 log CFU/ mL 이상 오염이 되어있어야지만 L. innocua보다 생육이 잘 되는 것을 확인하였다. Listeria 종 간의 혼합오염이 있 을 경우 현재 검출법으로는 L. monocytogenes의 검출이 어 려울 수 있다고 판단된다. 따라서 L. monocytogenes 검출 율을 높이는 새로운 증균배지 개발의 필요성을 확인하였다.

    향후 본 연구는 L. monocytogenes 검출률을 높여 국내 식품의 식품 안전에 기여 할 수 있으며 국내 식품 관리 규격 개정 시 기초가 되는 참고 자료로 활용 할 수 있을 것으로 생각된다.

    Acknowledgement

    이 논문은 2016년도 미래창조과학부 재원으로 한국식품 연구원의 지원(E0152202-02)을 받아 수행된 연구성과입니다.

    Figure

    JFHS-33-65_F1.gif

    Growth curves of pure and mixed cultures of Listeria spp. in LEB measured by RT-PCR. Growth pure cultures (Line graph) and as a mixed culture (Bar graph). Symbols are as follows: L. monocytogenes (,), L. innocua (,) L. ivanovii (,) and L. seeligeri (,).

    JFHS-33-65_F2.gif

    Growth curves of pure and mixed cultures based on L. monocytogenes in LEB by RT-PCR. Growth pure cultures of LM1), mixed culture of LM and LIN2) (panel A). Growth pure cultures of LM, mixed culture of LM and LV3) (panel B). Growth pure cultures of LM, mixed culture of LM and LS4) (panel C). Growth pure cultures of LM, LM, LIN, LV and LS mixed culture (panel D). Symbols are as follows: pure culture of LM (●, ··), Listeria spp. mixed culture (×, −). 1)L. monocytogenes 2)L. innocua 3)L. ivanovii 4)L. seeligeri.

    JFHS-33-65_F3.gif

    Monitoring the number of L. monocytogenes (LM ) and L. innocua (LIN ) viable cells in LEB.

    Panel A: LM 102 CFU/mL LIN 102 CFU/mL culture. Panel B: mixed culture (LM 102 CFU/mL and LIN 102 CFU/mL) Panel C: mixed culture (LM 2.0 × 102 CFU/mL and LIN 102 CFU/mL). Panel D: mixed culture (LM 103 CFU/mL and LIN 102 CFU/mL). Panel E: mixed culture (LM 104 CFU/mL and LIN 102 CFU/mL).

    Table

    Primers and probes used for the real time PCR assay to identify Listeria species18)

    Monitoring the number of viable cells in LEB (48 h at 35 ± 2°C)

    1)L. monocytogenes,
    2)L. innocua.,
    3)mean ± standard deviation (n = 9)

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