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ISSN : 1229-1153(Print)
ISSN : 2465-9223(Online)
Journal of Food Hygiene and Safety Vol.33 No.3 pp.185-192
DOI : https://doi.org/10.13103/JFHS.2018.33.3.185

Development of an Indirect Enzyme-Linked Immunosorbent assay for Rapid Detection of Adulteration of Food Allergen Mackerel in Processed Marine Foods

Jeong-Eun Lee, Ah-Yoon Kim, Sol-A Kim, Hyo-In Kim, Ji-Hye Park, Won-Bo Shim1,2*
Division of Applied Life Science, Graduate School, Gyeongsang National University, Jinju, Korea
1Institute of Agriculture and Life Science, Gyeongsang National University, Jinju, Korea
2Department of Agricultural Chemistry and Food Science & Technology, Gyeongsang National University, Jinju, Korea
Correspondence to: Won-Bo Shim, Department of Agricultural Chemistry and Food Science & Technology, Gyeongsang National University, Jinju, Gyeongnam 52828, Korea Tel: 82-55-772-1902, Fax: 82-55-772-1909 E-mail: wbshim@gnu.ac.kr
April 10, 2018 May 3, 2018 May 28, 2018

Abstract


The purpose of this study was to develop an indirect enzyme-linked immunosorbent assay (indirect ELISA) based on a monoclonal antibody (MAb) that is specific to mackerel thermal stable-soluble protein (TSSP), that can be used for the rapid detection of mackerel in processed marine foods. Among the four MAbs (3A5-1, 2, 9, and 12) developed in previous studies, the 3A5-2 MAb that showed high specificity and sensitivity were selected and used to develop the indirect ELISA method. The detection range of the indirect ELISA was 0.02%-0.001% and the detection limit of 0.001% was shown. No cross-reaction to other marine products and food ingredients was observed by the indirect ELISA. Processed marine foods containing mackerel with ≥ 0.3 O.D. value at 405 nm were estimated as positive samples by the indirect ELISA. Therefore, the indirect ELISA can be used as a rapid and sensitive method to identify mackerel authenticity and adulteration in processed marine foods.



수산가공식품 중 알레르겐 고등어 혼입여부 신속 검출을 위한 간접효소면역분석법의 개발

이 정은, 김 아윤, 김 솔아, 김 효인, 박 지혜, 심 원보1,2*
경상대학교 응용생명과학부
1경상대학교 농업생명과학연구원
2경상대학교 농화학식품공학과

초록


    Ministry of Oceans and Fisheries

    식품 알레르기의 발병은 인체의 면역체계와 깊은 관련 이 있으며 특정 항원이 포함된 식품을 섭취하거나 접촉· 호흡했을 때 체내 면역글로불린(IgE)이 과도하게 반응하 여 나타나는 현상으로, 대다수 사람에게는 별 영향이 없 는 식품이지만 특이 체질을 가진 사람은 식품 알레르겐으 로 인해 비정상적인 면역반응을 일으킨다. 증상으로는 두 드러기·혈관 부종·아토피 피부염 등과 같은 피부 증상이 흔하게 나타나며 설사·구토·복통 등의 소화기 증상과 심 한 경우 기관지가 확장되면서 기도가 좁아져 호흡곤란에 이를 수 있다1-3).

    보통 식품 알레르기는 영유아나 초등학생에게 알레르기 반응이 두드러지게 나타나며 성인의 경우 체질의 변화나 신체의 면역력이 저하되었을 경우에 나타나게 된다. 이러 한 식품 알레르기 반응은 식품 섭취 후에 바로 나타나는 즉시형도 있지만 1~2일 후에 나타나는 지연성 반응도 있 다. 그러므로 후자의 경우는 명확한 인과관계를 찾지 못 해 원인식품을 알 수 없는 경우도 빈번하게 발생한다4). 식 품은 여러가지 성분이 혼합된 것으로 주의를 기울이지 않 으면 단체급식소 및 레스토랑에서 제공하는 음식 또는 판 매되고 있는 가공식품의 섭취로 인해 알레르기 사고가 발 생할 가능성이 높으며 2018년 한국소비자원에서는 최근 2 년간 식품 알레르기 위해사고가 약 2배가량 증가하였다고 보고하였다23).

    식품 알레르기를 유발하는 원인식품 중 하나인 수산물 은 국내의 식생활에서 중요한 단백질 공급원으로 인식되 어 전체 식품 섭취량의 30% 정도에 해당될 만큼 높은 비 중을 차지하고 있다24).. 그러므로 수산물을 이용한 가공식 품의 다양화 및 생산량의 증가로 인해 레스토랑 및 단체 급식소에서도 수산물을 이용한 음식의 제공이 증가하고 있다. 따라서 현대사회에서는 식품 알레르기에 대한 관리 가 개인뿐만 아니라 집단 차원에서도 매우 중요해지고 있 다5). 최근에는 대전에 소재한 학교 단체급식소에서 고등 어에 의한 식품 알레르기 사고가 발생하였고, 단체급식이 이루어지고 있는 학교의 100명 중 13명이 식품과 관련된 알레르기 사고를 경험한 바 있다고 한다. 그러나 현재까 지도 일반 레스토랑 및 일부 단체급식소에서 식품 알레르 기에 관한 위험성 및 예방·관리에 대한 인식은 부족한 현 실이다6).

    식품의약품안전처는 2017년 5월 “어린이 기호식품 등의 알레르기 유발 식품 표시기준 및 방법”을 제정·고시하여 제과·제빵류, 아이스크림류, 햄버거, 피자 등을 조리·판매 하는 식품접객업소에서는 난류(가금류에 한한다), 우유, 메 밀, 땅콩, 대두, 밀, 고등어, 게, 새우, 돼지고기, 복숭아, 토 마토, 아황산류(이를 첨가하여 최종제품에 SO2로 10 mg/ kg 이상 함유한 경우에 한한다) 총 21종의 알르레기 유발 식품을 사용 또는 함유하는 경우에는 반드시 눈에 띄기 쉽게 바탕색과 구별되는 색상으로 표시하도록 의무화하였 다21). 이러한 정책은 국내에서도 식품 알레르기의 위험성 과 관리·예방의 필요성을 인지하고 관리 방안을 마련하고 있다는 것을 의미한다.

    알레르기를 유발하는 식품 알레르겐의 함유유무를 확인 하는 방법으로는 크게 기기분석법(HPLC와 LC-MS/MS), 특이항체를 이용하는 면역분석법(ELISA, immuno-strip), 대상 DNA를 검출하는 유전자검사법(PCR)으로 나눌 수 있다15,16). 그러나 HPLC법은 표준품과의 머무름시간(retention time)을 비교하고, DAD (diode array detector)에서의 spectra를 확인하는 것이 유일한 화학적 정보이며, 분석물질의 표준품을 반드시 확보하고 있어야 하는 단점이 있다. 또 한, LC-MS/MS 분석법은 각 성분에 대한 높은 선택성과 고감도 및 빠른 분석시간, 전처리의 용이성 등으로 HPLC 분석법과 GC 분석법의 장점을 모두 가지고 있는 방법이 지만 분석 장비가 매우 고가이어서 아직까지는 범용으로 사용하기가 어렵다는 단점이 있다. 유전자검사법은 conventional PCR법과 real-time PCR법 등이 식품 알레르겐 검출에 이용되고 있으며, real-time PCR법의 경우 증폭과 정을 실시간으로 모니터링 할 수 있고 추가적인 전기영동 확인과정이 없이 정성시험과 정량시험이 모두 가능하다는 장점이 있지만 여전히 현장에서 사용하기에는 고가의 장 비와 분석에 소요되는 시간이 필요하다는 단점을 갖고 있 다19). 실제로 식품산업현장에서 식품 알레르겐의 혼입유무 및 식품 알레르겐을 사용한 시설 및 설비 공정에서의 세 척효과를 확인하기 위해 ELISA법과 immuno-strip 등의 면 역분석법 kit들이 주로 사용되고 있다. 그러나 현재 개발 되어 판매되고 있는 면역분석법 kit들은 알레르기를 유발 하는 특정 단백질을 대상으로 개발하였기 때문에 이들 단 백질이 살균 및 조리 공정 등의 열처리 과정 중에 변성되 면 실제 가공식품에는 적용하기 어려움이 있다고 보고되 고 있다9). 현재까지 보고된 연구문헌 중 가공식품에 알레 르기 검출 ELISA kit를 적용하였을 때 시판되고 있는 제 품 kit 중 약 0.5~0.05%만이 가공식품 중 식품 알레르겐 의 혼입유무를 검출할 수 있다고 보고하였다18). 또한 손과 김(2012)은 고등어에 대한 다크론성 항체를 이용하여 ELISA 법을 개발하였으나 고압멸균 제품에서 분석하기에는 어려 움을 보고하였다13). 국내의 식품 알레르겐 면역분석법 개 발은 여전히 미흡하며 식품산업현장에서 신속하게 분석할 수 있는 방법이 체계화되어 있지 않은 실정이다. 따라서 식품 알레르기 사고로 인한 위험을 배제할 수 있도록 가 공식품 중에 식품알레르겐을 신속하게 검출하기 위한 분 석법을 개발할 필요성이 있다7).

    본 연구팀은 이전의 연구에서 고등어 어육 중 열 안정- 수용성 단백질의 존재와 이에 대한 단크론성 항체를 보고 하였고6), 이러한 열 안정-수용성 단백질은 가공식품 중 존 재하는 식품알레르겐의 존재 여부를 확인할 수 있는 마커 로써 이용이 가능하다는 것을 보고하였다. 따라서 본 연 구에서는 이전의 연구에서 개발한 고등어 어육 중 열 안 정-수용성 단백질에 특이한 단크론성 항체를 이용하여 간 접효소면역분석법(indirect ELISA)을 개발하였고, 수산가공 식품 중 식품 알레르겐으로서의 고등어 어육 혼입여부를 확인하는데 활용하고자 하였다.

    Materials and Methods

    시료 및 재료

    본 실험에는 대형마트에서 판매하고 있는 고등어 및 고 등어 가공식품류(통조림, 수산물가공품), 꽁치 및 삼치를 사용하였다. 실험에는 Nunc사(Roskilde, Denmark)의 microplate와 Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, U.S.A.)로부터 bovine serum albumin (BSA), ABTS [2,2’-azino-bis-(3- ethyl-benzothiazoline-6-sulfonic acid)], polyethylene sorbitan monolaurate (Tween 20) 그리고 Hydrogen peroxide (H2O2) 를 구입하여 사용하였고, goat anti-mouse IgG (H+L) peroxidase conjugate는 Thermo Fisher Scientific Inc. (Rockford, IL, U.S.A.), filter paper (Whatman No. 1)의 경우 Whatman (Buckinghamshire, UK), skim milk는 BD Difco (Le Pont de Claix, France)로부터 구입하였다. 그 외 indirect ELISA에 사용된 0.05 M phosphate buffered saline (PBS, pH 7.4), citrate buffer (pH 4.5)와 0.05% Tween 20 이 포함된 PBS (PBST, pH 7.4), 포화 ammonium sulfate 와 단백질 추출 및 희석에 사용된 0.15 M sodium chloride, 0.05 M carbonate buffer (pH 9.6), 25 mM tris-buffered saline (pH 7.4, TBS), 20 mM tris-HCl (pH 6.8)은 본 연구 실에서 준비하여 실험에 사용하였다. indirect ELISA결과 는 TECAN사 (Durham, USA)의 기기를 사용하여 흡광도 를 405 nm에서 측정하였다6).

    단크론성 항체 생산

    수산가공식품 중 고등어의 혼입여부를 확인할 수 있는 indirect ELISA법을 개발하기 위해 이전의 연구에서 보고 한 고등어 어육 중 열 안정-수용성 단백질에 특이적인 단 크론성 항체를 사용하였다6). 단크론성 항체는 4종(3A5-1, 2, 9, and 12 MAb)의 하이브리도마(hybridoma)로부터 생 산하였다. 간략히 설명하면 10주령 이상의 mouse 복강에 pristane (2,4,10,14-tetramethyl pentadecane, Sigma, USA) 을 0.5 mL를 주입하고, 1주일 후 대량 증식한 하이브리도 마를 수거하여 세포수를 0.2 mL 당 1 × 107 cell이 되도록 계산하여 mouse 복강에 주입하였다. 약 7~8일 후 복강으 로부터 복수액을 채취하여 3,000 rpm에서 원심분리 후 상 등액을 ammonium sulfate 침전법으로 정제하였고, 정제된 항체는 0.05 M PBS로 3일간 투석 후 동결 건조시킨 상 태로 −20°C에서 보관하면서 이후의 실험에 사용하였으며, 정제된 항체의 단백질 농도를 측정한 결과 4종의 항체 모 두 3 mg/mL의 수준이었다.

    간접효소면역분석법(indirect enzyme-linked immunosorbent assay; indirect ELISA)의 개발

    정제된 단크론성 항체를 이용하여 수산가공품 중 식품 알레르겐 고등어 혼입여부의 신속검출을 위해 민감도와 특이성이 높은 분석법을 개발하고자 indirect ELISA법의 각 단계인 coating, blocking, 1차 항체, 2차 항체에 대한 조건을 최적화 하였다.

    Coating 단계에 대한 최적 조건 확립을 위하여 본 연구 에서는 시료 추출 후 일반적으로 coating에 사용되는 버퍼 인 0.05 M carbonate buffer (pH 9.6), 0.05 M PBS (pH 7.4), 25 mM tris-buffered saline (pH 7.4), 20 mM Tris-HCl (pH 6.8)로 희석하여 microplate에 100 μL씩 분주한 후 coating 온도 및 반응시간을 37°C, 4°C에 1시간, 2시간, overnight 조건으로 진행하여 가장 민감도가 높은 coating 조건을 선택하였다. Blocking은 주로 사용되는 BSA (0.5%, 1%)와 skim milk (0.5%, 1%)를 사용하여 반응시간 및 온 도 등을 결정하였다. 각 well 당 200 μL씩의 blocking 용 액을 분주하였으며, 37oC에서 1시간, 4°C에서 하룻밤 (overnight) 정치시켜 반응을 유도하였으고 indirect ELISA 실험 결과 효과적으로 비특이적인 반응을 제거해주는 조 건을 선택하였다. 1차 항체의 조건은 확립된 coating 및 blocking 조건에 정제한 항체를 0.05 M PBS로 약 1~100 ng/mL의 농도로 희석하여 각 well 당 100 μL씩 분 주하고 37°C에서 1 시간 동안 반응하였으며, 2차 항체는 1~250 ng/mL로 PBS에 희석하여 각 well 당 100 μL씩 분 주하고 37°C에서 1시간 동안 반응시킨 후 민감도가 높은 최적의 1, 2차 항체 희석배수를 선정하였다. 모든 실험 결 과는 TECAN 기기로 405 nm에서 흡광도를 측정하였고, 모든 실험은 3반복 처리하여 얻은 평균값을 사용하였다.

    수산가공식품 중 고등어 검출

    개발된 indirect ELISA법에 대해 수산가공품 중 식품알 레르겐 고등어의 혼입여부를 확인할 수 있는 분석법으로 의 활용가능성을 평가하였다. 먼저 고등어와 동일한 등푸 른생선인 삼치와 꽁치를 이용하여 고등어의 선택적 판별 여부를 평가하였다. 냉동 고등어, 삼치 및 꽁치를 해동 후 일반 믹서기를 이용하여 어육을 분쇄시키고 각 시료를 유 리 tube에 5 g 씩 취하여 추출 효율이 높은 10 mL의 0.05 M carbonate buffer를 첨가한 후 vortex를 사용하여 30초 동안 균질화 하였다. 균질화된 시료는 100°C 끓는 물에서 15분 동안 중탕하여 추출하는 열처리(heating) 추출법을 사 용하였으며, 추출물은 50 mL의 conical tube로 옮겨 3,221 × g에서 10분 동안 원심분리한 후 상층액을 분리하였고 indirect ELISA 분석법에 사용하였다.

    추가로 개발된 indirect ELISA법을 이용하여 수산가공 식품 중 고등어 검출 가능여부를 확인하였다. 먼저 실험 실에서 준비한 시료는 마트에서 구입한 냉동 고등어 시료 를 해동 후 15, 30, 45, 60분씩 끓는 물에서 중탕하여 준 비하였고, 통조림 제조에서 이용되는 고압멸균 조건으로 121°C에서 15분, 30분 처리하여 준비하였다. 시판 수산가 공 식품은 마트에서 즉석으로 조리하여 판매하고 있는 고 등어구이 제품 3점과 A와 B사의 고등어 통조림 제품과 그 외 꽁치 통조림을 구입하여 실험에 사용하였다. 통조 림 제품은 침지액을 충분히 제거한 후 시료로 사용하였으 며, 수산가공식품의 전처리는 앞서 설명한 방법과 동일한 방법으로 0.05 M carbonate buffer를 이용하여 추출한 후 상층액을 indirect ELISA로 분석하였다.

    Results and Discussion

    단크론성 항체 선택

    고등어 어육 중 열 안정-수용성 단백질에 특이적인 단 크론성 항체 4종을 앞서 설명한 바와 같이 ammonium sulfate 법으로 정제하였고, 정제된 항체 4종 중 가장 역가 가 높은 항체 1종을 선택하여 indirect ELISA의 최적화를 진행하고자 하였다. Fig. 1에서 보는 바와 같이 4종의 항 체를 이용하여 indirect ELISA를 실시한 결과 3A5-1, 3A5- 2, 3A5-9와 3A5-12 항체 모두 민감도가 비슷한 것으로 확 인되었지만 3A5-2 항체가 고등어 함유량 0.01%에서도 다 른 3종의 항체보다 높은 흡광도인 0.749를 나타내어 민감 도 측면에서 우수한 것으로 확인되었다. 그러므로 이후 실 험에서는 3A5-2 항체를 이용하여 indirect ELISA법 개발 을 최적화하였다.

    Indirect ELISA법의 최적화

    수산가공품 중 식품 알레르겐 고등어의 신속검출 및 혼 입여부를 확인할 수 있는 indirect ELISA법 개발을 위해 각 단계인 coating, blocking, 1차 항체, 2차 항체에 대한 조건을 최적화 하였다. 분석법의 민감도를 높이기 위해 Chen 등14)의 방법을 변형하여 0.05 M carbonate buffer와 0.05 M PBS로 단백질을 추출한 후 indirect ELISA의 코 팅항원으로 사용한 결과 고등어 함유량 0.01%에서 0.05 M carbonate buffer로 추출한 시료의 흡광도 값이 0.58로, 0.05 M PBS로 추출한 시료(흡광도 0.18)보다 높은 흡광 도를 나타내었다. 따라서 민감도가 높은 indirect ELISA법 을 개발하기 위한 추출용매로 0.05 M carbonate buffer를 선택하였다. 또한 Fig. 2에서 보는바와 같이 고등어 추출 액의 희석버퍼에 따른 민감도를 확인한 결과 고등어 함유 량 0.01%에서 총 4종의 희석버퍼의 흡광도 값이 0.05 M carbonate buffer에서 0.17, 0.05 M PBS 0.42, 25 mM tris- buffered saline와 20 mM Tris-HCl에서는 0.4로 확인되었다. 따라서 고등어 시료 추출액을 0.05 M PBS로 희석한 후 indirect ELISA법의 시료로 코팅한 경우가 가장 높은 민 감도를 나타내었기 때문에 indirect ELISA법을 위한 시료 전처리는 방법은 고등어 시료를 0.05 M carbonate buffer 로 추출하고 이를 0.05 M PBS로 1:1 희석하는 조건으로 확립하였다. 준비된 시료를 이용하여 indirect ELISA법의 coating 반응 온도 및 시간을 비교한 결과 Fig. 3A에서 보 는 바와 같이 고등어 함량 0.02%에서 4°C에서 overnight 반응시킨 조건이 흡광도 1.25로 확인되었고, 그 외 4°C 및 37°C에서 1, 2시간 반응시킨 조건들은 약 0.4-0.8 흡광도 를 나타내었다. 따라서 높은 민감도의 분석법 확립을 위 해서 4°C에서 overnight 반응을 coating 조건으로 선택하 였다.

    추가로 비 특이적인 반응을 효과적으로 제거하기 위한 최적의 blocking 조건 확립을 위해 0.5와 1% BSA와 skim milk를 blocking 용액을 사용하여 실험한 결과 고등어 함 유량 0%에서 나타난 흡광도 값이 0.08-0.1로 모두 효과적 으로 비 특이적인 반응을 제거해주는 것을 확인할 수 있 었으나 고등어 함유량 0.005%에서의 흡광도 값을 비교한 결과 1% BSA 용액을 사용하였을 때 비 특이적인 반응이 낮으면서 가장 높은 흡광도 0.8 값이 나타나 이를 최종 선 택하였다(Fig. 3B). 또한, blocking의 온도와 시간에 따른 반응성을 확인한 결과 모든 조건에서 유사한 결과를 보였 기 때문에 반응시간을 단축할 수 있는 37°C, 1시간 조건 을 선택하였다.

    항체의 경우 농도를 선정할 때 저농도의 항체는 낮은 민감도를, 고농도의 항체는 비 특이적인 반응을 유도할 수 있기 때문에 분석법 개발 시 항체의 농도를 최적화시키는 것은 매우 중요하다. Fig. 3C에서 보는 바와 같이 1차 항 체의 최적 희석배수를 결정하기 위해 1차 항체원액(1 mg/ mL)을 3200, 6400, 9600, 12800, 19200배로 희석하여 실 시한 indirect ELISA결과에서 0, 0.001, 0.005, 0.02, 1%의 코팅항원에 대해 3200과 6400배의 항체 농도가 비특이적 인 반응없이 유의적으로 높은 흡광도를 나타내었다. 또한 고등어 함유량 0.001%에서 3200과 6400배로 희석한 항체 의 흡광도가 각각 0.4로 두 희석배수 사이에 큰 차이가 나 타나지 않아 6400배를 선택하였다, 이상의 결과로 볼 때 최적의 indirect ELISA 조건으로 coating은 4°C, overnight, blocking은 1% BSA, 37°C, 1시간, 마지막으로 1차 항체는 6400배, 37°C, 1시간으로 결정하였다.

    개발된 indirect ELISA법의 평가

    앞서 개발된 indirect ELISA법에 대해 민감도와 특이성 을 확인하였다. 민감도 측정을 위해 고등어 추출액을 0.05 M PBS로 1, 0.2, 0.1, 0.02, 0.01, 0.005, 0.002, 0.001, 0% 로 희석한 후 indirect ELISA로 확인한 결과 Fig. 4A에서 보는 바와 같이 0.001% (0% 흡광도 표준편차 양의 값: 0.0003 × 3) 까지 측정이 가능한 민감도 높은 분석법으로 확인 되었다. 또한, 최적화된 indirect ELISA법의 특이성 을 확인하기 위해 식품알레르겐으로 알려진 수산물(꽁치, 삼치, 볼락, 새우, 오징어), 너트류 및 콩류(땅콩, 호두, 아 몬드, 캐슈넛, 대두) 및 축산물(소고기, 돼지고기, 염소고 기, 오리고기, 난백)을 앞서 언급한 바와 같이 0.05 M carbonate buffer로 추출한 후 indirect ELISA로 분석한 결 과 Table 1과 같이 다른 수산물, 너트류 및 콩류, 축산물 에서는 0.084-0.187의 낮은 흡광도를 나타내었고, 고등어 에서는 2.475로 높은 흡광도 값이 확인되어 개발된 indirect ELISA법은 고등어를 특이적으로 분석할 수 있는 것으로 확인되었다. 이러한 결과는 본 연구에 사용된 3A5-2 항체 가 이전의 연구에서 보고한 바와 같이 고등어의 어육 중 열 안정-수용성 단백질에 특이하게 반응하는 것에 기인한 것으로 판단된다6). Son과 Kim13)도 가공식품 중 고등어 parvalbumin의 검출을 위한 sandwich ELISA법을 보고하 였고, 검출한계는 3 ng/mL 수준(고등어 총 함량 0.01% 수 준)으로 보고하였다13). 본 연구에서 개발된 indirect ELISA 은 이미 보고한 ELISA법 보다는 더욱 민감한 분석법으로 확인되었다.

    수산 가공 식품 중 고등어 어육 검출

    고등어는 최근 2년 사이 어획량이 3분의 1로 급감(2015 년 53,323톤 → 2017년 18,902톤)하여 가격이 상승하고 있 으며, 국립수산과학원에서는 고등어의 부가가치를 위한 가 공기술을 개발하고 있는 실정이다22). 따라서 고등어의 가 격 상승으로 인해 꽁치, 청어 등이 고등어 가공품으로 둔 갑될 가능성도 조심스럽게 예상이 되고 있다. 또한 식품 의약품안전처에서 발표한 “어린이 기호식품 등의 알레르 기 유발 식품 표시기준 및 방법” 고시에도 고등어는 식품 알레르겐으로 표시하도록 관리하고 있다21). 따라서 본 연 구에서는 앞서 개발한 indirect ELISA를 이용하여 식품 중 혼입된 고등어의 검출 가능 여부를 확인하였다. 우선 0.05 M carbonate buffer를 이용한 고등어 추출액을 꽁치 추출 액으로 1, 0.2, 0.1, 0.02, 0.01, 0.005, 0.002, 0.001, 0%로 희석한 후 indirect ELISA로 그 민감도를 확인하였다. Fig. 4B에서 보는 바와 같이 고등어-꽁치 추출물은 (0% 흡광 도 표준편차 양의 값: 0.0006 × 3) 0.002% 까지 측정이 가 능하였으며, 0%인 꽁치 시료에서는 0.175의 흡광도로 반 응을 보이지 않았지만 고등어가 포함되어 있는 추출물에 서는 0.3-1.25의 흡광도로 높은 반응성을 나타내었다. 다 른 수산물 또는 식품재료의 성분이 indirect ELISA법에 간 섭영향을 미치는지에 대해 추가연구가 필요하지만 개발한 분석법을 이용한다면 수산가공품 중 식품 알레르겐인 고 등어를 분석하는데 있어 indirect ELISA법이 효과적으로 이용될 수 있을 것이라 판단된다.

    추가로 개발한 indirect ELISA법을 적용하여 고등어 수 산 가공품의 혼입여부를 판별할 수 있는지 확인하였다. 먼 저 일반적인 식품가공공정에서의 제조과정으로 처리하였 을 경우 항체가 인식하는 항원성의 유지정도를 확인하기 위해 구입한 고등어를 조리과정으로는 100°C에서 15분에 서 60분까지 처리하였고, 멸균과정으로는 121°C에서 15분 에서 30분까지 처리하였다. 처리된 시료는 앞서 설명한 방 법과 같이 단백질을 추출하였고 indirect ELISA법으로 분 석하였다. 그 결과 Fig. 5에서 보는바와 같이 조리과정 100°C에서 60분, 멸균과정 121°C에서 30분까지 처리한 고 등어 시료 모두가 양성으로 확인되었고, 멸균을 30분 처 리한 시료는 15분 처리한 시료와 비교했을 때 흡광도가 감소하는 것으로 확인되었으나 통조림 제조업체에 문의한 결과 일반적인 통조림 멸균 시간이 30분 이내인 것을 감 안하면 indirect ELISA를 이용한 분석에는 문제가 없을 것 으로 판단된다. 이러한 결과는 본 연구의 indirect ELISA 법 개발에 사용된 3A5-2 항체가 고등어 어육 중 열안정- 수용성 단백질(37 kDa)에 특이하게 반응하는 것으로 설명 할 수 있으며, 열처리된 가공제품에서도 고등어를 충분히 검출할 수 있는 것으로 확인되었다. 고등어 혼입여부를 확 인하는데 적용 가능여부를 확인하기 위해 고등어와 유사 한 등푸른 생선인 꽁치와 삼치를 조리(100°C, 30분)와 멸 균(121°C, 30분) 조건으로 각각 처리하고 이를 추출한 후 indirect ELISA법을 분석한 결과 Fig. 6에서와 같이 모든 조건에서 고등어는 높은 흡광도를 나타내어 양성으로 확 인할 수 있었으나 꽁치와 삼치는 음성으로 확인되었다. 따 라서 개발된 indirect ELISA법이 수산가공식품 중 고등어 의 혼입여부를 확인하는 도구로써의 활용이 가능하다고 판단되었다. 손과 김의 parvalbumin을 항원으로 이용한 ELISA법은 100°C로 처리한 고등어 시료는 검출이 가능하 였으나, 121°C에서 처리한 고등어 시료는 검출이 불가능 하다고 보고하고 있다13). 그러나 본 연구에서 개발된 indirect ELISA법은 기존에 보고된 sandwich ELISA법에 비해 멸 균제품까지 검출이 가능한 것으로 확인되었기 때문에 대 부분의 가공식품에 적용이 가능한 분석법으로 활용이 가 능할 것이라 예상된다.

    추가로 마트에서 즉석으로 조리되어 판매하고 있는 고 등어 구이, 조림(매콤조림, 간장조림)과 고등어 통조림 및 꽁치 통조림을 구입하여 indirect ELISA법으로 분석한 결 과 Table 1과 같이 즉석조리제품인 구이와 조림 고등어 시 료와 고등어 통조림 시료는 0.5 이상에서 1.0 이하의 흡 광도를 확인하였고, 음성시료인 꽁치 통조림은 0.1 정도의 흡광도를 나타내었다. 이를 토대로 본 연구에서는 0.3(꽁 치 시료의 흡광도 × 3) 흡광도 이하인 시료는 음성, 초과 하는 시료는 양성으로 분류하였다. 통조림 및 몇몇 고등 어 구이 제품에서는 흡광도가 낮게 확인되었는데, 이러한 이유는 검출대상 단백질을 둘러싸고 있는 주위 환경, 즉 서로 다른 식품의 특성(지방이나 염의 함량, pH 등)에서 유래하는 소위 매트릭스 효과(matrix effect)가 항원-항체 반응에 영향을 주었기 때문인 것으로 예상된다10). 특히, 직 접적으로 열원에 노출되는 시료의 경우는 높은 열변성으 로 인하여 항원성이 감소되었을 수도 있다. 그럼에도 불 구하고 이상의 결과를 종합하면, 본 연구에서 고등어 어 육 중 열 안정-수용성 단백질에 대한 특이항체 3A5-2를 이용하여 개발한 indirect ELISA법은 통조림과 같은 일부 식품에서 정량적인 확인이 어렵지만 일반적인 가공식품 중 고등어의 함유유무를 정성적으로 분석하는데 효과적으 로 활용 가능한 것으로 판단된다13).

    Acknowledgement

    이 논문은 2015년 해양수산부 재원으로 한국해양과학기 술진흥원의 지원을 받아 수행된 연구임(수산물 유해미생 물 신속분리기술과 등온비색 PCR 기반 확립).

    Figure

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    Selection of a monoclonal antibody for the development of Indirect ELISA.

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    Development of highly sensitive Indirect ELISA based on 3A5-2 MAb by selecting an optimum dilution buffer as a coating buffer for sample extracts. A: 0.05 M PBS (pH 7.4), B: 0.05 M Carbonate (pH 9.6), C: 20 mM Tris-HCl (pH 6.8), D: 25 mM TBS (pH 7.4).

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    Optimization of experimental factors for the development of highly sensitive Indirect ELISA based on 3A5-2 MAb. A: coating conditions (temperature and time), B: blocking solution, C: dilution of primary antibody.

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    Standard curve of the Indirect ELISA based on 3A5-2 MAb according to concentration of mackerel extracts in PBS (A) and the results of the Indirect ELISA for artificially adulterated mackerel in mackerel pike (B).

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    Measurement of protein antigenicity in mackerel extracts treated by heating at boiling water (A) and autoclaving at 121oC (B).

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    Confirmation of availability of the Indirect ELISA based on 3A5-2 MAb to identify authenticity of mackerel.

    Table

    Analysis of processed marine foods, meats, egg white, and nuts by the Indirect ELISA based on 3A5-2 MAb

    1)+: Positive, O.D ≥ 0.3
    2)-: Negative, O.D < 0.3

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