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ISSN : 1229-1153(Print)
ISSN : 2465-9223(Online)
Journal of Food Hygiene and Safety Vol.33 No.3 pp.193-199
DOI : https://doi.org/10.13103/JFHS.2018.33.3.193

Production and Characterization of Monoclonal Antibodies Specific to PAT Protein Expressed in Genetically Modified Herbicide-Resistance Maize

Sol-A Kim, Jeong-Eun Lee, Won-Bo Shim1,2, Sung-Jo Kang3, Duck-Hwa Chung1*
Division of Applied Life Science, Graduate School, Gyeongsang National University, Jinju, Korea
1Department of Agricultural Chemistry and Food Science & Technology, Gyeongsang National University, Jinju, Korea
2Institute of Agriculture and Life Science, Gyeongsang National University, Jinju, Korea
3MADI-LAB, Inc., Jinju, Korea
Correspondence to: Duck-Hwa Chung, Department of Agricultural Chemistry and Food Science & Technology, Gyeongsang National University, Jinju, Gyeongnam 52828, Korea Tel: 82-55-772-1422, Fax: 82-55-772-1909 E-mail: dhchung@gnu.ac.kr
May 28, 2018 June 2, 2018 June 5, 2018

Abstract


In this study, PAT protein of genetically modified maize was prepared from the recombinant E. coli strain BL21 (DE3), and mice were immunized with the recombinant PAT protein. After cell fusion and cloning, two hybridoma cells (PATmAb-7 and PATmAb-12) were chosen since the monoclonal antibodies (Mabs) produced by them were confirmed to be specific to PAT protein in the indirect enzyme-linked immunsorbent assay (ELISA) and western blot tests. There were no cross-reactions of either Mabs to other GM proteins or to the extracts of non-GM maize. The ELISA based on the PATmAb-7 can sensitively detect 0.3 ng/g PAT protein in corn. These results indicate that the developed Mabs can be used as bio-receptors in the development of immunosensors and biosensors for the rapid and simple detection of GM corn adulterated in foods.



제초제 내성 유전자 변형 옥수수 중 PAT단백질에 특이한 단크론성 항체의 생산과 특성 확인

김 솔아, 이 정은, 심 원보1,2, 강 성조3, 정 덕화1*
경상대학교 응용생명과학부
1경상대학교 농화학식품공학과
2경상대학교 농업생명과학연구원
3㈜매디랩

초록


    Ministry of Food and Drug Safety
    15162MFDS055

    ‘유전자변형생물체’ 또는 ‘유전자변형식품’이라고 불리 는 genetically modified organism (GMO)은 생물체의 유전 자 중 유용한 유전자를 취하여 그 유전자를 갖고 있지 않 은 생물체에 삽입하여 유용한 성질을 나타나게 한 것이다. 이와 같은 유전자재조합기술을 활용하여 재배·육성된 농 산물·축산물·수산물·미생물 및 이를 원료로 하여 제 조·가공한 식품(건강기능식품을 포함) 중 정부가 안전성 을 평가하여 입증된 경우에만 식품으로 사용할 수 있으며, 이를 유전자변형식품이라 한다1,2).

    GMO는 미국 몬산토사가 1995년 제초제 저항성 GM 콩 을 상품화하면서 대중에게 처음 알려지기 시작하였고, 그 당시 약 120만 ha 정도이던 유전자 재조합 농산물의 재배 면적은 1999년 대비 2009년에 약 13배 증가하고 있어 원 하지 않더라도 유전자 재조합 농산물을 접할 기회는 점점 증가하고 있는 추세이다. 그 중 제초제 저항성 농작물은 그 생산의 편리성으로 인해 생산성이 향상되어 점차 생산 량이 늘어나고 있는 실정이기 때문에 전 세계적으로 GM 농산물의 생산 및 교역이 증대되고 있다. 그러나 전 세계 적으로 GM 식품의 잠재적 안전성이 논란되면서 각국의 정부에서는 GMO 안전성 평가 및 표시제를 시행하고 있 다3). EU에서는 1998년 9월부터, 일본 및 호주에서는 2001 년 4월 및 2001년 12월부터 GMO 표시제를 각각 시행해 오고 있다. 우리나라에서도 식품위생법에 따라 2001년 7 월부터 안전성 심사가 완료된 GM 콩 및 옥수수 원료를 사용하는 27개 식품 유형에 대하여 GMO 표시제를 시행 한 후 2007년 11월에 식품용으로 안전성 심사 및 승인이 완료된 GM농산물 면화, 유채, 사탕무를 추가하였다. 최근 에는 “식품 등의 표시기준” 고시에 GMO 표시 의무가 확 대되어 GM 식품에 GMO DNA가 남아 있다면 모든 원재 료에 GMO 표시를 의무적으로 해야 되며, GMO DNA가 잔류하지 않는 식용유 등에 대해서는 표시를 하지 않아도 되도록 하고 있다4).

    앞서 언급한 바와 같이 국내외적으로 GMO에 대한 안 전성 측면은 여전히 논란이 있지만 전 세계적으로 인구의 증가로 인한 식량소비 증가와 기후변화로 인한 곡물 생산 량의 감소로 인해 글로벌 식량 위기가 예상되고 있는 상 황에서 GMO는 식량문제를 해결할 수 있는 대안으로 여 겨지고 있다5-8). 2015년 현재 재배되고 되고 있는 GMO 작물의 재배면적은 콩(9,210만 ha)과 옥수수(5,360만 ha), 면화(2,400만 ha), 카놀라(850만 ha) 순으로 그 중 제초제 내성에 대한 작물의 재배가 9,590만 ha로 가장 높게 보고 되고 있으며 GMO 재배국가의 순위는 미국, 브라질, 아르 헨티나, 인도, 캐나다 순이다(2015년 GM작물 재배 면적). 우리나라의 경우 식량자급률이 30%에도 미치지 못하는 수준으로 쌀을 제외한 주요 곡물을 미국 등 농산물 수출 국으로부터의 수입에 의존하고 있는 상황이며 일본에 이 어 세계적으로 손꼽히는 GMO 수입 대국에 해당한다. 따 라서 국내 소비자들은 비록 승인 받은 GMO 작물이라고 하더라도 가공식품 중 사용여부에 대한 관심과 안전성 평 가를 받지 않은 미심사 GMO 작물이 수입 및 유통 여부 등에 관심이 커지고 있는 상황이다9-11). 이러한 GMO의 안 전성 논란과 가공식품에서의 표시제 등의 시행으로 인해 다양한 원료와 가공식품에 유전자 변형 농산물의 혼입 여 부를 신속하게 확인할 수 있는 분석법 개발에 관한 요구 도 증가하고 있는 추세이다.

    GMO를 검출하기 위해 주로 사용되는 방법으로는 유전 학적 방법과 면역화학적 방법이 이용되고 있는데 주로 GMO 작물 검사에 사용되는 방법으로는 유전학적 방법인 PCR이 국제 표준분석법으로 추천되고 있으며, 상업화된 여러 GMO 작물에 대하여 PCR을 이용한 분석방법이 정 립되어 분석법으로 활용되고 있다. 그러나 PCR은 범용성, 비용 및 분석시간 면에서 단점을 가지고 있어 중소규모의 생산현장에서 손쉽게 적용 가능한 현장 검사법의 보급이 필요하다12-14). 국외의 경우 PCR법의 단점을 해결하기 위 해 다양한 면역분석법을 개발해 오고 있으며, Envirologix 사, Romerlabs사, Neogen사 등은 단백질 분석용 ELISA kit나 lateral flow test kit등을 제조하여 판매하고 있다. 이 러한 면역학적 분석방법은 현장에서 GMO의 혼입여부를 측정할 수 있는 방법으로 전세계적으로 많은 수요가 있는 것으로 보고하고 있다. 그러나 현재까지는 GM 콩에 대한 연구보고15-16)는 있었으나, 국내의 기술에 의한 GMO분석 용 ELISA kit나 lateral flow test kit 제품은 보고되고 있지 않고 있으며, GM 옥수수에 대한 연구보고는 되고 있지 않 은 상황이다.

    제초제 phosphinothricin (PPT)는 식물에서 glutamine 합 성효소의 활성을 억제하여 세포 내 암모니아의 빠른 축적 을 가져와 광호흡(photorespiration)이 중단되어 결국 식물 세포를 사멸시키는 것으로 알려져 있다17). GM 옥수수에 많이 발현되는 phosphinothricin-N-acetyltransferase (PAT) 단백질은 acetyl coenzyme A가 존재 시 PPT의 자유아민 기(free NH2 group)를 아세틸화하여, glutamine 합성효소 의 활성을 억제하지 않기 때문에 PPT에 대한 내성을 제 공한다. 또 유전자변형식품 승인 현황(2018. 3. 28. 기준) 에서 승인된 190 품종 중 옥수수는 83종(단일형질 24종과 후대교배 중 56종 그리고 기타 3종)으로 GMO 작물 중 비율이 높다18).

    따라서 본 연구에서는 제초제 저항성 GM 옥수수에서 발현되는 PAT 단백질을 형질전환 된 대장균으로부터 대 량 생산하고, 생산된 PAT 단백질을 항원으로 사용하여 단 크론성 항체 개발과 그 특성을 확인하고자 하였다.

    Materials and Methods

    실험재료 및 기기

    GM 옥수수 유전자 확보를 위해 옥수수 3종(DP-004114- 3, MON89034 XMON88017, Bt11XMIR604XTC1507X53- 07XGA21)를 식품의약품안전처로부터 분양 받았다. GM 옥수수에 대한 항원 준비를 위해 E. coli strain BL21 (DE3), DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, USA), pET-15b (Novagen, USA), LB broth (Difco, USA), IPTG (Isopropyl β-D-1- thiogalactopyranoside), Ni-NTA resin (Qiagen, USA)을 구 입하여 사용하였다. PAT단백질에 대한 단크론성 항체를 개발하기 위해 BALB/c mouse를 효창사이언스(Hyochang Science Inc., Korea)로부터 구입하여 사용하였고, SDSPAGE과 western blot는 Laemmli19-20)등의 방법에 준하여 실시하였으며 그 외 필요한 시약 및 재료는 구입하여 사 용하였다. 기타 사용된 시약은 50 mM carbonate buffer (pH 9.6), 50 mM phosphate buffer saline (PBS, pH 7.4), 50 mM phosphate bufferd saline containing 0.05% Tween20 (PBST), 2 M H2SO4, 10 mM citrate buffer (pH 4.0), 30% hydrogenperoxide, 0.1 M glycine (pH 4.0), 1 M Tris-HCl (pH 8.0), 1% sodium citrate, 10% NaCl, 2 mM borate buffer (pH 7.2), 1 M Tris-HCl (pH 9.0) 등을 사용하였으 며, UV-spectrometer[Shimadzu (Japan)], 역위상차현미경 (Olympus, Japan)과 CO2배양기(Forma Scientific, USA)를 사용하였다. 시료분석과 유전자증폭을 위해 원심분리기 (Hanil, Korea), ELISA reader (Bio-Rad, USA), PCR 기기 (Bio-Rad, USA)를 사용하였다.

    PAT 단백질의 확보

    식품의약품안전처로부터 제공받은 GM 옥수수 3종 DP- 004114-3, MON89034 XMON88017, Bt11XMIR604XTC 1507X5307XGA21으로부터 PAT유전자를 추출하고 PCR과 cloning을 거쳐 PAT 유전자가 삽입된 pET-15b벡터를 전이 시킨 형질전환 대장균을 확보하여 PAT 단백질의 생산과 정제를 수행하였다. 형질 전환된 E. coli strain BL21 (DE3) 를 1 L의 LB broth에 접종하여 37°C에서 약 2시간 배양 하고 OD600 값이 0.4 정도가 되면 IPTG (isopropyl β-D-1- thiogalactopyranoside)를 0.5~1 mM 되도록 첨가하여 다시 37°C에서 4시간 추가 배양하여 단백질의 발현을 유도하였 다. 배양이 끝난 후 3,500 rpm 에서 15분간 원심분리하여 균체를 회수하였고, 단백질을 분리 정제하기 위하여 native condition법으로 실시하였다. 즉, 균체를 binding buffer (10 mM imidazole, 500 mM NaCl, 10 mM Tris-Cl) 5 mL 에 resuspending한 뒤 이를 ice상에서 sonication 한 후 원 심분리 하여 상등액을 회수하였다. 여기에 준비한 Ni-NTA resin (Qiagen, USA) 1.5 mL를 첨가하여 4°C에서 1시간 반 응한 후 column에 resin을 충진하였다. 반응물이 다 충진 되면 15 mL의 binding buffer와 10 mL washing buffer (60 mM imidazole, 500 mM NaCl, 10 mM Tris-Cl)로 각각 washing한 후, 5~7 mL의 elution buffer (200 mM imidazole, 500 mM NaCl, 10 mM Tris-Cl)로 PAT 단백질만을 순수하 게 분리하였다. 각각의 tube로부터 일부 채취하여 SDSPAGE를 수행하여 원하는 단백질이 순수하게 분리되었는 지 확인하였고 정제된 단백질은 정량을 한 후 냉동(−20°C) 보관하면서 항원과 코팅항원으로 사용하였다.

    단크론성 항체 확보를 위한 hybridoma 세포주 개발

    준비된 항원을 complete freund's adjuvant와 1:1(v/v)로 유화시켜 생후 6주된 암컷 BALB/C mouse에 마리당 200 μL씩 복강에 주입하여 1차 면역을 실시하였고, 1차 면역 후 2주 간격으로 동일한 면역원을 incomplete freund's adjuvant와 동량 혼합하여 추가 면역을 2회 실시하였으며, 세포 융합 4일 전에 2배의 면역원만을 복강 내 주사하여 최종 면역 시켰다. 3차 면역 일주일 후 mouse의 꼬리 정 맥에서 1 μL의 혈액을 채취하여 간접 효소면역분석법 (indirect enzyme-linked immunosorbent assay; iELISA)으 로 항체의 역가를 측정하였다. 그 중 가장 높은 역가를 갖 는 mouse로부터 spleen cell을 분리한 후 한국생명공학연 구원으로부터 분양 받은 myeloma cell (SP2)을 사용하여 Kohler and Milstein21)의 방법으로 세포융합을 실시하였고, Mckearn 등22)의 무한대 희석법으로 cloning을 실시하여 단 일클론의 hybridoma cell을 획득하였다

    PAT에 대한 단크론성 항체 생산 및 정제

    선택된 hybridoma cell은 대량 배양한 후 mouse 복강에 200 μL를 주입하여 복수액을 생산하였으며, 1주일 후 생 산된 복수액을 채취하여 ammonium sulfate 침전법23)으로 정제한 후, PBS를 이용하여 3일 동안 투석하였다. 친화성 칼럼을 통한 추가정제는 protein G column을 이용하여 정 제하였다. 즉, 먼저 PBS buffer 5 mL로 protein G Column 을 안정화한 다음 ammonium sulfate 침전법으로 정제된 항체와 PBS를 동량 희석한 후 column에 주입하였다. 불 순물을 씻어 주기 위하여 다시 PBS buffer 15 mL을 흘려 주고 15 mL의 elution buffer (0.1 M glycine, pH 4.0)로 용 출시킨 후 1 mL씩 분획하였다. 분획한 시료는 즉시 1 M Tris-HCl (pH 8.0)로 중화시키고 280 nm에서 흡광도를 확 인한 후 PBS로 투석을 실시하였으며, 동결 건조시킨 후 −20°C에 보관하면서 실험에 사용하였다.

    생산된 PAT 단크론성 항체의 특성 확인

    개발된 항체의 교차반응성을 확인하기 위해 정제된 발 현 PAT 단백질과 GM 옥수수에서 추출한 단백질(PAT), 유 전자 재조합 농작물에서 주로 발현되는 CP4-EPSPS, MEPSPS, 2MEPSPS, PMI, mCry3A, Cry3Bb1, Cry34Ab1, Cry35Ab1 및 Cry2Ab2 단백질 등을 이용하여 western blot 법과 간접효소면역분석법으로 확인하였다. 먼저, western blot은 Towbin 등24)의 방법에 준하여 실시하였다. SDS-PAGE 후 단백질은 PVDF membrane (Millipore, USA)에 transfer buffer (25 mM tris, 192 mM glycine and 5% methanol)와 전사장치(Bio-Rad)를 이용하여 전사시킨 후 PVDF membrane은 TBST (0.05% Tween 20 in tris-buffered saline buffer)를 이용하여 3회 세척하고 3% skim milk를 이용하 여 37oC에서 1시간 blocking 하였다. 이후 blocking 처리 된 막은 TBST를 이용하여 3회 세척한 후 hybridoma cell 배양액을 이용하여 37°C에서 1시간 반응시키고 TBST로 4차례 세척 후 희석률 1:6000의 2차 항체인 goat anti-mouse alkaline phosphate conjugate (Bio-Rad)로 37oC에서 1시간 반응시켰다. TBST로 5차례 세척 후, AP conjugate substrate kit (Bio-Rad)를 이용하여 발색시켜 PVDF membrane 상에 서 확인하였다. 간접효소면역분석법은 정제된 단백질 및 옥수수 추출액을 96-well microplate (Nunc, Roskildeenmark) 에 분주하고 1시간 동안 37°C에서 코팅시킨 후 0.05% Tween 20이 포함된 PBS (PBST, pH 7.4)로 3회 세척하였 다. 비 특이적인 반응을 방지하기 위해 1% skim milk로 1시간 동안 37°C에서 blocking 시킨 후 PBST로 4회 세척 하였고, 세척된 well에 hybridoma cell 배양액을 100 ul씩 분주하고, 1시간 동안 37°C에서 반응시킨 후 다시 PBST 로 5회 세척하였다. 세척된 well에 2차 항체 goat-anti-mouse IgG-HRP (Sigma Chemical Co.)를 100 μL씩 분주하여 1시 간 동안 37oC에서 반응시킨 후 PBST로 6회 세척하고, 기 질용액인 2,2'-azino-di-3-ethyl-benzthiazoline-sulfonate (ABTS, Sigma Chemical Co.)를 각 well에 100 μL씩 첨가하여 37°C 에 30분 반응시킨 다음 405 nm에서 흡광도를 측정하였다.

    Results and Discussion

    재조합 PAT 단백질의 생산 및 정제

    GM 옥수수 중 PAT 단백질에 대한 단크론성 항체를 개 발하기 위해 형질 전환된 E. coli strain BL21 (DE3)을 앞 서 설명한 바와 같이 배양 IPTG를 첨가하여 단백질의 발 현을 유도하였다. 발현이 유도된 단백질은 Ni-NTA resin 을 이용하여 정제를 실시하였고, 정제도를 SDS-PAGE로 확인하였다. 그 결과 Fig. 1에서와 같이 재조합 PAT 단백 질을 순수 분리할 수 있었고, column으로부터 정제된 단 백질은 PBS로 투석하여 버퍼를 교환하였고, 단백질 정량 을 한 후 냉동(−20°C)보관하면서 실험에 사용하였다.

    재조합 PAT 단백질의 항원성 확인 및 hybridoma 개발

    정제된 PAT단백질을 이용하여 BALB/C mouse에 2주 간 격으로 3차 면역을 실시한 후 마우스 꼬리 정맥에서 채혈 하고 간접효소면역분석법으로 항혈청 역가를 측정하여 재 조합 PAT 단백질의 항원성을 확인하였다. 그 결과 Fig. 2 에서와 같이 PAT단백질로 면역한 대부분의 마우스에서 106 배 이상의 희석배수에서도 항체 역가가 나타나 본 연 구에서 확보한 재조합 PAT 단백질이 항원성이 높은 것으 로 확인되었다. 역가가 높은 마우스를 마지막 4차 면역 후 비장세포(spleen cell)를 분리하여 골수종 세포(myeloma cell)와 세포융합 및 클로닝을 거쳐 단일클론 hybridoma 세 포주를 개발하였다. 총 12종의 단일클론 세포주를 확보하 였고 western blot으로 확인한 결과, Fig. 3에서 patMab 2 와 5번 hybridoma가 생산하는 항체는 PAT 단백질에 반응 성이 약한 것으로 판단되어 제외하고 최종 10종의 hybridoma 세포주를 이후의 실험에 사용하였다.

    단크론성 항체 정제 및 특성 확인

    선정된 10종의 hybridoma의 배양상등액을 이용하여 western blot 상에서의 재조합 PAT 단백질과 실제 GM 옥 수수 시료에 대한 반응성을 확인하였다. 그 결과 Fig. 4에 서와 같이 PAT는 PATmAb7과 mAb12 2종의 항체만 GM 옥수수 추출물과 반응하는 것을 확인할 수 있었다. 나머 지 8종의 항체는 재조합 PAT 단백질에 반응성이 높고 GM 옥수수 추출물에는 반응성이 약한 것으로 확인되었다(data 미제시). PAT 단백질에 대한 항체는 중국의 Xu 등25)이 보 고한 것이 이외에는 외국에서도 보고되고 있지 않으며 국 내에서도 유전자 변형 콩에 대한 면역분석법 개발에 관한 연구는 보고되고 있으나, GM 옥수수에 대한 연구는 보고 되고 있지 않은 것으로 확인되었다. 그러므로 개발된 PAT 항체는 GM 옥수수를 신속하게 검출할 수 있는 면역분석 법 및 바이오센서의 개발에 바이오리셉터로서 활용가능성 이 높을 것으로 예상된다.

    GM 옥수수에 대한 항체를 확보하기 위해 PATmAb-7 and PATmAb-12 hybridoma cell을 대량으로 증식시킨 후 마우스에 주사하고 복수액을 생산한 후 ammonium sulfate 법과 protein G column을 이용하여 정제를 수행하였고, 그 정제도를 SDS-PAGE로 확인하였다. Fig. 5에서 보는 바와 같이 PATmAb-7과 PATmAb-12 두 항체 모두 대표적인 항 체패턴인 heavy chain과 light chain을 나타내었고 면역글 로불린(immunoglobulin)임을 확인할 수 있었다. 정제된 항 체 2종에 대해 isotype을 확인한 결과 2종 모두 heavy chain 과 light chain이 각각 IgG1과 κ type으로 확인되었다(data 미제시).

    정제된 PATmAb-7 and PATmAb-12 항체에 대해 다른 GMO 작물에 도입된 특이 단백질인 MEPSPS, 2MEPSPS, PMI, mCry3A, Cry3Bb1, Cry34Ab1, Cry35Ab1 및 Cry2Ab2 와 non-GM 옥수수의 추출물에 대한 교차반응성을 확인한 결과 Fig. 6과 같이 PAT 단백질에만 특이적으로 각각 반 응하였고, 일반 콩 및 옥수수 추출물들 및 다른 GMO 작 물에 도입된 특이 단백질과 non-GM 옥수수의 추출물에는 교차반응을 보이지 않았다. 이상의 결과로 볼 때 개발된 2종의 항체(PATmAb-7 and PATmAb-12)는 GM 옥수수에 서 발현되는 PAT 단백질에 특이적으로 반응하는 항체로 확인되었고, 2종의 항체를 이용한 면역분석법과 바이오센 서의 개발 가능성을 제시할 수 있었다.

    PAT단백질에 대한 항체와 면역분석법의 개발에 관한 연 구는 콩에서 주로 발현되는 제초제내성 단백질 CP4-EPSPS 에 비해 미흡한 것으로 확인되고 있다. PAT단백질에 대한 항체 및 면역분석법의 개발은 Xu 등25)이 GM 유채에서 발 현되는 PAT단백질을 검출하기 위한 면역분석법의 개발이 유일한 것으로 조사되었다. 그 연구에서는 다클론성 항체 (polyclonal antibody)를 생산하여 효소면역분석법을 개발 하였고 민감도는 20 ng/mL였다. 본 연구에서 개발된 효소 면역분석법의 감도는 0.3 ng/mL로 Xu 등25)이 보고한 효소 면역분석법보다 매우 높은 감도를 가지는 것으로 확인되 었다. 추가로 다클론성항체의 경우 민감도 및 특이성이 실 험에 사용된 동물에 따른 차이가 크고, 1회성 생산이라는 단점이 있다. 반면에 단크론성 항체는 확보한 hybridoma 를 이용하여 일정한 수준의 특성을 가지는 항체를 꾸준히 생산할 수 있다. 따라서 최근의 면역센서 또는 바이오센 서 개발 분야에서는 다클론성 항체에 비해 본 연구에서 개발된 단크론성 항체가 더 적합한 것으로 판단된다. Fig. 7

    Acknowledgement

    본 연구는 2016년도 식품의약품안전처의 연구개발비 (15162MFDS055)로 수행되었으며 이에 감사드립니다.

    Figure

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    SDS-PAGE analysis of PAT protein purified by Ni-NTA resin. PAT protein was produced from E. coli strain BL21 (DE3) transformed with pET 15b plasmid expressing PAT gene. Lane 1: Marker, lane 2: whole cell lysate before IPTG induction, lane 3: whole cell lysate after IPTG induction, lane 4 and 5: Purified PAT protein.

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    Titration of antisera from immunized mice with recombinant PAT protein by indirect ELISA.

    JFHS-33-193_F3.gif

    Western blot analysis for the selection of hybridoma cells producing monoclonal antibodies specific to PAT protein. 10 μg of PAT protein were loaded at each lane, and culture supernatants diluted 1:500 were used. Lane 1: Marker, lane 2-12: culture media of hybridomas.

    JFHS-33-193_F4.gif

    Western blot analysis of recombinant PAT protein and an extract of GM maize with anti-PAT antibodies. Lane 1: 50 ng recombinant PAT protein, lane 2: 100 ng recombinant PAT protein, lane 3: extract of GM maize. Antibodies were the culture media of hybridomas, PATmAb-7 and PATmAb -12 diluted 1:5,000.

    JFHS-33-193_F5.gif

    SDS-PAGE analysis of the purified monoclonal antibodies. Lane M: marker, lane 1: ascites fluids, lane 2: unbound fraction, lane 3 and 4: Elutes, bound fractions.

    JFHS-33-193_F6.gif

    Immunoreactivity of PATmAb-7 against other recombinant proteins which can be expressed in GMO and the extracts of non-GM maize by indirect ELISA.

    JFHS-33-193_F7.gif

    Standard curve of indirect ELISA for the rapid detection of PAT protein in GM maize.

    Table

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