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ISSN : 1229-1153(Print)
ISSN : 2465-9223(Online)
Journal of Food Hygiene and Safety Vol.33 No.4 pp.289-295
DOI : https://doi.org/10.13103/JFHS.2018.33.4.289

Development and Validation of Analytical Method for Wogonin, Quercetin, and Quercetin-3-O-glucuronide in Extracts of Nelumbo nucifera, Morus alba L., and Raphanus sativus Mixture

Gill-Woong Jang, Eun-Young Park, Seung-Hyun Choi, Sun-il Choi, Bong-Yeon Cho, Wan-Sup Sim, Han-Xinggao, Hyun-Duk Cho1, Ok-Hwan Lee*
Department of Food Science and Biotechnology, Kangwon National University, Chuncheon 24341, Korea
1Haram Co. Ltd. Jeungpyeong 27914, Korea
Correspondence to: Ok-Hwan Lee, Department of Food Science and Biotechnology, Kangwon National University, Chuncheon 24341, Korea Tel: 82-33-250-6454, Fax: 82-33-259-5561 E-mail: loh99@kangwon.ac.kr
May 30, 2018 June 17, 2018 July 2, 2018

Abstract


The aim of this study was to develop and validate an analytical method for determining the presence of wogonin, quercetin, and quercetin-3-O-glucuronide in extracts of Nelumbo nucifera, Morus alba L., and Raphanus sativus mixtures. We evaluated the specificity, linearity, precision, accuracy, limit of detection (LOD), and limit of quantification (LOQ) of analytical methods for wogonin, quercetin, and quercetin-3-O-glucuronide using high performance liquid chromatography. Our result showed that the correlation coefficients of the calibration curve for wogonin, quercetin, and quercetin-3-O-glucuronide were 0.9999. The LOD for wogonin, quercetin, and quercetin-3-O-glucuronide ranged from 0.09 to 0.16 and those for the LOQ ranged from 0.26 to 0.48 μg/mL. The inter-day and intra-day precision values of wogonin, quercetin, and quercetin-3-O-glucuronide ranged from 0.74 to 1.87 and from 0.28 to 1.12%, respectively. The inter-day and intra-day accuracies were 99.96~115.88% and 99.73~114.81%, respectively. Therefore, the analytical method was validated for the detection of wogonin, quercetin, and quercetin-3-O-glucuronide in extracts of Nelumbo nucifera, Morus alba L., and Raphanus sativus mixtures.



연잎, 상엽, 건조 무 혼합 추출물의 지표성분 wogonin, quercetin 및 quercetin-3-O-glucuronide의 분석법 개발 및 검증

장길웅, 박은영, 최승현, 최선일, 조봉연, 심완섭, 한웅호, 조현덕1, 이옥환*
강원대학교 식품생명공학과
1하람

초록


    Ministry of SMEs and Startups

    연잎(Nelumbo nucifera)은 예로부터 출혈성 위궤양이나 위염, 치질, 출혈, 설사, 야뇨증, 각종 독성 물질에 대한 중 화작용을 하는 것으로 알려져 민간치료제로 사용되어 왔 고 폴리페놀 성분과 quercetin이나 rutin과 같은 플라보노 이드 성분들을 다량 함유하고 있어 항산화, 미백 등의 기 능성을 기대할 수 있다1-3). 상엽(Morus alba L.)은 중국에 서 열병 치료, 혈압 강하, 관절 강화, 시력 개선, 간 개선 등에 오랫동안 사용됐고 최근 보고에 따르면 당뇨병 또한 예방할 수 있는 것으로 알려졌으며4-7), 면역 결핍 바이러 스 및 다양한 호흡기 바이러스에 대해 강력한 항바이러스 활성을 나타내는 플라보노이드가 풍부하게 함유되어 있다 고 보고된 바 있다8). 십자화과 채소인 무(Raphanus sativus) 는 혈당저하, 이뇨작용, 정장작용, 해열, 지혈작용, 니코틴 제거 작용 및 담석증 치료 등과 같은 생리활성 효과들이 있는 것으로 알려져 있으며9,10), 항산화 작용을 나타내는 물질인 식이섬유, phenol계, flavonoid계 색소 및 방향족 amine 등이 다량으로 함유되어 있다고 보고되어 이들의 생리활성 성분에 대한 연구들이 진행되고 있다11-15). 이와 같은 생리적 기능들을 가지고 있다고 알려져 있는 연잎, 상엽, 건조 무에는 활성산소를 억제해 항산화 효과에 도움 을 주는 flavonoid계 물질 wogonin, quercetin 및 quercetin- 3-O-glucuronide가 함유되어 있어 다양한 기능성 연구가 수행되고 있다16,17). 이러한 기능성을 나타내는 소재는 단 일로 사용되었을 때 보다 혼합 추출물로 사용할 때 시너 지효과로 인해 그 효능이 증가된다고 연구가 보고된 바 있어 다양한 혼합물에 대해 연구가 진행 중에 있으나18-20), 연잎, 상엽, 건조 무의 혼합물에 대해서는 아직 연구된바 가 없다.

    최근 세계화에 따른 식생활의 서구화로 다양한 건강문 제가 야기되고 있어 생리활성을 나타내는 기능성 식품에 대한 소비자의 관심 및 수요가 증가하고 있고 다양한 소 재의 제품이 개발되고 있다. 건강 기능성 식품을 개발하기 위해서는 기능성과 안전성이 과학적 실험을 통해 확인되어 야 하며 원료와 지표성분에 대한 표준화가 요구된다21). 표 준화란 원료의 생산부터 제품의 제조 과정 전반에 걸쳐 사 용된 정보와 기술들을 기록하고 관리함으로써 원료가 함 유하고 있는 고유 성분들의 변동을 가능한 한 적게 하여 원료와 제품의 품질이 최대한 일정하게 유지하는 것을 말 하며, 표준화는 지표성분을 일반적인 지표로 이용한다. 제 품에서 원료의 기능성이 유지되는 것은 지표성분의 함유 량을 통해 확인할 수 있으므로 이를 확인하기 위해 공인 된 분석방법 또는 정밀한 분석방법을 사용해야 하며, 규 격에 정확한 기준을 설정하기 위해 분석방법의 신뢰성 및 타당성이 검증되어야 한다22). 연잎, 상엽, 무의 경우 각 원 료에 함유된 지표성분 분석법은 다양하게 연구되어 온 반 면, 세 가지 소재의 복합추출물에 함유된 flavonoid계 물 질의 동시 분석법이 보고되어 있지 않아 그들의 지표성분 인 wogonin, quercetin, quercetin-3-O-glucuronide의 동시 분석법의 신뢰성 및 타당성을 확보하기 힘든 실정이다.

    따라서 본 연구에서는 연잎, 상엽, 건조 무 혼합추출물 에 함유되어 있는 지표성분 wogonin, quercetin, quercetin- 3-O-glucuronide의 동시 분석법 개발 및 유효성 검증(method validation)에 대한 연구를 실시하였다.

    Materials and Methods

    실험재료

    본 실험에서 사용된 혼합 추출물은 하람(Jeungpyeong, Korea)에서 제공받아 사용하였으며, 혼합 추출물은 연잎 (Leaves of Nelumbo nucifera), 상엽(Leaves of Morus alba L.), 건조 무(Dried Raphanus sativus)를 13가지 비율로 혼 합해 각각 열수와 에탄올 추출한 후, 여과하고 농축하여 동결건조기(Ilshinbiobase Co., Ltd, Gyeonggi, Korea)를 이 용하여 동결건조물로 제조한 뒤 실험에 사용하였다(Table 1).

    표준물질 wogonin은 ChromaDex, Inc (Irvine, CA, USA), quercetin은 Sigma Aldrich (St. Louis, MI, USA), quercetin- 3-O-glucuronide는 Extrasynthese (Genay, France)에서 구입 하여 사용하였다. 용매로 사용한 dimethyl sulfoxide (DMSO) 는 Junsei Chemical (Tokyo, Japan)에서 구입하였으며 acetonitrile은 J.T. Baker (Phillipsburg, NJ, USA), phosphoric acid는 Sigma Aldrich에서 구입하여 사용하였다.

    Wogonin, quercetin, quercetin-3-O-glucuronide 분석

    Wogonin, quercetin과 quercetin-3-O-glucuronide의 HPLC 분석은 Yang 등23)의 분석방법을 변형하여 실시했으며, 세 개의 표준물질을 동시 분석하였다. 분석에 사용한 기기는 Waters 2695 Separation Module HPLC system과 Waters 996 Photodiode Array Detector (Waters, Milford, MA, USA) 로 분석조건은 Table 2와 같으며 분석용 column은 Waters SunFireTM C18 (4.6 mm × 250 mm, 5.0 μm, Waters)이었다.

    표준용액 및 시험용액의 조제

    Wogonin, quercetin 및 quercetin-3-O-glucuronide 표준물 질을 각각 5 mg 취한 뒤, 10 mL 정용플라스크를 이용해 500 μg/mL의 농도가 되도록 DMSO로 표선까지 정용하여 이를 stock solution으로 하였다. Working solution은 제조 된 stock solution을 이용하여 1.5625, 3.125, 6.25, 12.5, 25, 50, 100 μg/mL이 되도록 DMSO로 희석하여 사용하였다. 시험용액은 동결 건조된 시료 26종(혼합 비율을 달리한 열 수 및 에탄올 추출물 각 13종)을 각각 25 mg을 칭량한 후 25 mL 정용플라스크를 이용해 1000 μg/mL의 농도가 되도 록 DMSO로 표선까지 채운 뒤, 이를 0.45 μm syringe filter (Whatman, Maidstone, UK)로 여과하여 시험용액으로 했다.

    분석법의 유효성 검증

    분석법의 유효성 검증(method validation)은 ICH (International Conference for Harmonization) 가이드라인24)을 근 거로 하여 개발된 분석법의 특이성(specificity), 직선성 (linearity), 정밀성(precision), 정확성(accuracy), 검출한계 (limit of detection, LOD) 및 정량한계(limit of quantitation, LOQ)를 이용하여 분석법의 유효성을 검증하였다.

    특이성

    표준물질 wogonin, quercetin, quercetin-3-O-glucuronide 및 혼합 추출물을 HPLC로 분석하여 얻은 chromatogram 을 비교하여 wogonin, quercetin 및 quercetin-3-O-glucuronide가 선택적으로 분리가 되는지 확인했으며 photodiodearray (PDA) spectrum을 확인하여 동일한 spectrum을 나 타내는지 확인하였다.

    직선성

    Wogonin, quercetin 및 quercetin-3-O-glucuronide 표준물 질을 1.5625, 3.125, 6.25, 12.5, 25, 50, 100 μg/mL의 농도 로 제조해 HPLC를 이용하여 3회 반복 측정했으며, 각 표 준물질의 peak에 대한 면적과 농도비의 관계를 표시하는 검량선을 작성하고 작성한 검량선으로부터 얻어진 상관계 수(correlation coefficient, R2) 값을 통해 직선성을 확인하였다.

    정밀성 및 정확성

    정확성 및 정밀성을 구하기 위하여 지표성분의 함량을 알고 있는 연잎, 상엽, 건조 무 혼합추출물에 표준용액 wogonin, quercetin과 quercetin-3-O-glucuronide를 25, 50, 100 μg/mL의 농도씩 각각 첨가하였다. 일내(Intra-day) 정 밀성 및 정확성을 확인하기 위해 하루에 3회 반복하여 HPLC로 분석하였으며, 일간(Inter-day) 정밀성 및 정확성 을 확인하기 위해 3일간 반복하여 HPLC로 분석하였다. 분석하여 얻어진 peak의 머무름 시간(retention time)과 PDA spectrum을 비교하여 정성을 하고 작성한 검량선에 시험용 액의 peak 면적을 대입하여 wogonin, quercetin과 quercetin- 3-O-glucuronide의 농도를 계산하였다. 각 결과 값의 표준 편차를 결과 값의 평균으로 나눈 비인 상대표준편차(relative standard deviation, RSD)로 일내 및 일간 정밀성을 확인했 으며, 정확성은 다음 식을 이용하여 첨가한 농도에 대비 하여 회수된 농도를 계산함으로서 회수율을 구해 정확성 을 확인하였다.

    % r e c o v e r y = ( C f C u ) C a × 100

    • Cf : Concentration of spiked sample

    • Cu : Concentration of sample

    • Ca : Concentration of standard

    검출한계 및 정량한계

    Wogonin, quercetin 및 quercetin-3-O-glucuronide의 검출 한계(LOD) 및 정량한계(LOQ)는 검량선의 기울기와 표준 편차에 근거하는 방법을 사용했으며 다음 식을 이용하여 확인하였다.

    Eq2.gif

    • σ: The standard deviation of the responseple

    • S: The slope of the calibration curve

    Results and Discussion

    Wogonin, quercetin 및 quercetin-3-O-glucuronide의 크로마토그램

    연잎, 상엽, 건조 무 추출물에 함유된 지표성분을 구명 하기 위해서는 문헌에 보고된 성분들에 대한 동시분석법 이 요구되어 기존의 분석법23)을 참고하여 wogonin, quercetin 및 quercetin-3-O-glucuronide 표준물질들에 대한 최대흡수 파장을 검토한 결과, 각각 275.6, 255.6, 256.7 nm에서 최 대흡수파장을 나타냈다(Fig. 1). 각 물질의 최대흡수파장인 275.6, 255.6, 256.7 nm 및 기존 보고된 논문의 분석 파장 인 334 nm에 따른 세 물질의 peak 면적을 비교하여 최적 면적 값을 나타내는 파장 값을 확인한 결과, 334 nm에서 세 물질의 최적 peak 면적 값을 나타내 최적분석파장은 334 nm로 설정하였다.

    특이성 및 직선성

    특이성이란 추출물, 불순물 등이 혼합되어 있는 시료에 서 분석대상물질을 선택적으로 측정할 수 있는 능력을 말 한다. 표준용액과 혼합 추출물의 chromatogram을 비교하 여 wogonin, quercetin과 quercetin-3-O-glucuronide의 peak 를 확인한 결과 Fig. 2와 같이 quercetin-3-O-glucuronide는 다른 성분들의 간섭 없이 선택적으로 분리되었음을 확인 했으나 wogonin과 quercetin의 경우 혼합 추출물에서 검출 되지 않았다. Quercetin-3-O-glucuronide는 혼합 추출물과 표준용액에서의 머무름 시간과 일치한 것을 확인하였으며, 표준용액과 혼합 추출물의 PDA spectrum 결과에서도 동 일한 spectrum을 나타냈으며 이를 통해 특이성을 확인하 였다(Fig. 2).

    한편, wogonin, quercetin 및 quercetin-3-O-glucuronide 표준용액을 1.5625, 3.125, 6.25, 12.5, 25, 50, 100 μg/mL 농도로 단계적으로 희석하여 HPLC로 분석한 결과, wogonin, quercetin, quercetin-3-O-glucuronide의 표준검량선은 각각 y = 12627x − 6405.8, y = 25056x − 23503, y = 17782x − 11835 로 나타났으며 상관계수(R2) 값은 세 가지 성분 모두 0.9999 로 나타나 우수한 직선성을 보였다(Table 4).

    정밀성 및 정확성

    농도를 알고 있는 연잎, 상엽, 건조 무 혼합 추출물에 표준용액을 각각 저농도(3.125 μg/mL), 중농도(12.5 μg/mL), 고농도(50 μg/mL)로 첨가한 뒤 HPLC로 분석했을 때, 각 측정 결과 값 사이의 근접성을 확인하여 정밀성을 평가하 며, 회수율을 측정하여 정확성을 평가하였다. 정밀성의 결 과는 상대표준편차(RSD)로 확인했다. Wogonin, quercetin 및 quercetin-3-O-glucuronide의 정밀성은 Table 3과 같이 일간 정밀성에서 각각 0.76~1.24%, 0.90~1.40%, 0.74~ 1.87%를 나타냈으며 일내 정밀성에서는 0.12~1.06%, 0.28~ 1.12%, 0.52~0.92%로 5% 이하의 우수한 정밀성을 나타냈 다. 정확성은 회수율을 측정하여 나타내며 Table 3과 같이 wogonin, quercetin 및 quercetin-3-O-glucuronide 의 일간 정확성은 99.99~107.97%, 99.96~115.88%, 99.73~111.91% 를 나타냈고 일내 정확성은 100.36~108.88%, 99.77~ 114.81%, 99.91~112.44%로 우수한 정확성을 나타내었다.

    검출한계 및 정량한계

    검출한계와 정량한계는 ICH 가이드라인에 근거하였으 며 wogonin, quercetin 및 quercetin-3-O-glucuronide의 검 출한계는 각각 0.16 μg/mL, 0.09 μg/mL, 0.15 μg/mL로 측 정됐으며 정량한계는 각각 0.48 μg/mL, 0.26 μg/mL, 0.45 μg/mL로 나타났다. 이상의 결과를 통해 연잎, 상엽 및 건 조 무 혼합 추출물의 wogonin, quercetin 및 quercetin-3-Oglucuronide은 HPLC를 이용해 동시분석이 가능하며 정량 분석이 가능한 것으로 나타났다(Table 4).

    연잎, 상엽, 건조 무 혼합 추출물의 wogonin, quercetin, quercetin-3-O-glucuronide 함량분석

    확립된 분석법을 이용하여 혼합 추출물 내 wogonin, quercetin 및 quercetin-3-O-glucuronide의 함량분석 결과 wogonin과 quercetin은 혼합 추출물 내에서 검출되지 않았 다. 이러한 결과는 Sultana와 AnwaR25) 및 Beevi 등26)의 연 구와도 같은 경향으로 시료로 사용된 작물의 품종, 환경 및 생산시기에 따라 flavonoid 성분들의 함량이 달라지며 추출공정의 표준화에 따라 주요 지표성분의 함량이 달라질 수 있기 때문인 것으로 사료된다27). Quercetin-3-O-glucuronide 의 함량은 11번 비율(100:0:0)로 에탄올을 이용해 추출한 샘 플에서 가장 높은 함량을 나타냈으며 복합추출물 중에서 는 1번(80:20:0) 샘플에서 높은 수준을 보였다. 이는 연잎 추출물에 quercetin-3-O-glucuronide가 다량 함유되어 있기 때문인 것으로 사료된다. 전체 샘플들의 quercetin-3-Oglucuronide 함유량은 불검출~50.95 mg/dry weight g의 함 량을 가지고 있는 것으로 분석되었다(Table 5).

    Acknowledgments

    본 연구는 2017년도 중소벤처기업부의기술개발사업지원 에의한연구임[S2491053].

    Figure

    JFHS-33-289_F1.gif

    PDA spectrums of wogonin (A) quercetin (B) and quercetin- 3-O-glucuronide (C) in STD, Spiked sample and extracts of Nelumbo nucifera, Morus alba L. and Raphanus sativus mixture.

    JFHS-33-289_F2.gif

    HPLC chromatograms of wogonin, quercetin and quercetin- 3-O-glucuronide Standard (A), Nelumbo nucifera, Morus alba L. and Raphanus sativus (50:30:20) mixture extracts. (B).

    Table

    Mixture ratio of Nelumbo nucifera, Morus alba L. and Raphanus sativus

    HPLC conditions of wogonin, quercetin and quercetin-3- O-glucuronide analysis for extracts of Nelumbo nucifera, Morus alba L. and Raphanus sativus mixture

    Precision and accuracy of wogonin, quercetin and quercetin-3-O-glucuronide analysis for Nelumbo nucifera, Morus alba L. and Raphanus sativus extracts

    Correlation coefficients of the calibration curves, and limit of detection (LOD) and limit of quantification (LOQ) of wogonin, quercetin and quercetin-3-O-glucuronide analysis for Nelumbo nucifera, Morus alba L. and Raphanus sativus extracts

    Concentration of quercetin-3-O-glucuronide in samples

    Reference

    1. Lee, K.S. , Kim, M.G. , Lee, K.Y. : Antioxidative activity of ethanol extract from lotus (Nelumbo nucifera) leaf . J Korean Soc Food Sci Nutr., 35, 182-186 (2006).
    2. Deng, S. , Deng, Z. , Fan, Y. , Peng, Y. , Li, J. , Xiong, D. , Liu, R. : Isolation and purification of three flavonoid glycosides from the leaves of Nelumbo nucifera (Lotus) by high-speed counter-current chromatography . J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci., 877, 2487-2492 (2009).
    3. Choi, S.J. , Kim, S.Y. , Jeong, Y.J. , Ku, C.S. , Ha, B.J. , Chae, H.J. : Stability evaluation of the cosmetics containing lotus leaf extract . KSBB Journal., 26, 83-86 (2011).
    4. Katsube, T. , Imawaka, N. , Kawano, Y. , Yamakazi, Y. , Shiwaku, K. , Yamane, Y. : Antioxidant flavonol glycosides in mulberry (Morus alba L.) leaves isolated based on LDL antioxidant activity . Food Chem., 97, 25-31 (2006).
    5. Doi, K. , Kojima, T. , Makino, M. , Kimura, Y. , Fujimoto, Y. : Studies on the constituents of the leaves of Morus alba L . Chem Pharm Bull., 49, 151-153 (2001).
    6. Zhishen, J. , Mengcheng, T. , Jianming, W. : The determination of flavonoid contents in mulberry and their scavenging effects on superoxide radicals . Food Chem., 64, 555-559 (1999).
    7. Lee, H.O. , Jeon, Y.S. , Kim, M.Y. : The antioxidative effects and isolation and characterization of the extracts from Morus alba L. J Korean Soc Food Sci Nutr., 24, 94-100 (2011).
    8. Du, J. , He, Z.D. , Jiang, R.W. , Ye, W.C. , Xu, H.X. , Paul, P.H. : Antiviral flavonoids from the root bark of Morus alba L . Phytochemistry., 62, 1235-1238 (2003).
    9. Jung, D.H. : Biochemical activity of food. Seonjinmunwhasa, Seoul., 72-74 (1998).
    10. Jung, M.S. , Lee, G.S. , Chae, H.J. : In vitro biological activity assay of ethanol extract of radish . Appl Biol Chem., 47, 67-71 (2004).
    11. Son, J.Y. , Son, H.S. , Cho, W.D. : Antioxidant effect of onion skin extract . Korean J Soc Food Sci., 14, 16-20 (1998).
    12. Kang, J.A. , Kang, J.S. : Effect of garlic and orion on plasma and liver cholesterol and triacylglycerol and platelet aggregation in rats fed basal cholesterol supplemented diets . Korean J Nutr., 30, 132-138 (1997).
    13. Lee, S.H. , Hwang, I.G. , Lee, Y.R. , Joung, E.M. , Jeong, H.S. , Lee, H.B. : Physicochemical characteristics and antioxidant activity of heated radish (Raphanus sativus L.) extracts . J Korean Soc Food Sci Nutr., 38, 490-495 (2009).
    14. Kwon, O.C. , Woo, K.S. , Kim, T.M. , Kim, D.J. , Hong, J.T. , Jeong, H.S. : Physicochemical characteristics of garlic (Alliumsativum L.) on the high temperature and pressure treatment . Korean J Food Sci Technol., 38, 331-336 (2006).
    15. Kim, H.Y. , Woo, K.S. , Hwang, I.G. , Lee, Y.R. , Jeong, H.S. : Effects of heat treatments on the antioxidant activities of fruits and vegetables . Korean J Food Sci Technol., 40, 166-170 (2008).
    16. Moon, J.H. , Tsushida, T. , Nakahara, K. , Terao, J. : Identification of quercetin 3-O-β-D-glucuronide as an antioxidative metabolite in rat plasma after oral administration of quercetin . Free Radic Biol Med., 30, 1274-1285 (2001).
    17. Hollman, P.C. , de Vries, J.H. , van Leeuwen, S.D. , Mengelers, M.J. , Katan, M.B. : Absorption of dietary quercetin glycosides and quercetin in healthy ileostomy volunteers . Am J Clin Nutr., 62, 1276-1282 (1995).
    18. Pedrielli, P. , Skibsted, L.H. : Antioxidant synergy and regeneration effect of quercetin, (−)−epicatechin, and (+)-catechin on α-tocopherol in homogeneous solutions of peroxidating methyl linoleate . J Agric Food Chem., 50, 7138-7144 (2002).
    19. Wang, S. , Meckling, K.A. , Marcone, M.F. , Kakuda, Y. , Tsao, R. : Synergistic, additive, and antagonistic effects of food mixtures on total antioxidant capacities . J Agric Food Chem., 59, 960-968 (2011).
    20. Liu, R.H. : Health benefits of fruit and vegetables are from additive and synergistic combinations of phytochemicals . Am J Clin Nutr., 78, 517S-520S (2003).
    21. Kim, Y.H. , Bae, D.B. , Park, S.O. , Lee, S.J. , Cho, O.H. , Lee, O.H. : Method validation for the determination of eleutherosides and β-glucan in Acanthopanax koreanum . J Korean Soc Food Sci Nutr., 42, 1419-1425 (2013).
    22. Choi, S.H. , Yoo, C.K. , Hwang, J.H. , Lee, G.B. , Lee, Y.J. , Lee, B.Y. , Lee, O.H. : Modification and validation of analytical method for oxypaeoniflorin and paeoniflorin in Moutan cortex radicis extract . J Korean Soc Food Sci Nutr., 46, 1091-1096 (2017).
    23. Yang, H.M. , Sun, C.Y. , Liang, J.L. , Xu, L.Q. , Zhang, Z.B. , Luo, D.D. , Chen, H.B. , Huang, Y.Z. , Wang, Q. , Lee David, Y.W. , Yuan, J. , Li, Y.C. : Supercritical-Carbon dioxide fluid extract from Chrysanthemum indicum enhances anti-tumor effect and reduces toxicity of bleomycin in tumor-bearing mice . Int J Mol Sci., 18, 465 (2017).
    24. ICH Harmonised Tripartite Guideline. Validation of analytical procedures: text and methodology Q2(R1). International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use, 1-13 (2005).
    25. Sultana, B. , Anwar, F. : Flavonols (kaempeferol, quercetin, myricetin) contents of selected fruits, vegetables and medicinal plants . Food Chem., 108, 879-884 (2008).
    26. Beevi, S.S. , Narasu, M.L. , Gowda, B.B. : Polyphenolics profile, antioxidant and radical scavenging activity of leaves and stem of Raphanus sativus L . Plant Foods Hum Nutr., 65, 8-17 (2010).
    27. Oomah, B.D. , Mazza, G. , Kenaschuk, E.O. : Flavonoid content of flaxseed. Influence of cultivar and environment . Euphytica., 90, 163-167 (1996).