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ISSN : 1229-1153(Print)
ISSN : 2465-9223(Online)
Journal of Food Hygiene and Safety Vol.33 No.4 pp.296-305
DOI : https://doi.org/10.13103/JFHS.2018.33.4.296

Development and Validation of Analytical Method for Determination of Fungicide Spiroxamine Residue in Agricultural Commodities Using LC-MS/MS

Shin-Min Park, Jung-Ah Do*, Seung-Hee Lim, Ji-Hye Yoon, Won-Min Pak, Hye-Sun Shin, Ju-Hee Kuk1, Hyung-Wook Chung
Pesticide and Veterinary Drug Residues Division, Food Safety Evaluation Department, National Institute of Food and Drug Safety Evaluation, Ministry of Food and Drug Safety, Cheongju, Korea
1Nutrition and Functional Food Research Team, Food Safety Evaluation Department, National Institute of Food and Drug Safety Evaluation, Ministry of Food and Drug Safety, Cheongju, Korea
Correspondence to: Jung-Ah Do. Pesticide and Veterinary Drug Residues Division, Food Safety Evaluation Department, National Institute of Food and Drug Safety Evaluation, Ministry of Food and Drug Safety Tel: 82-43-719-4211, Fax: 82-43-719-4200jado@korea.kr
May 9, 2018 May 26, 2018 July 11, 2018

Abstract


Spiroxamine, one of fungicides, is used to control powdery mildew in various crops and black yellow sigatoka in bananas. The major strength of spiroxamine is to control powdery mildew in various crops and bananas yellow sigatoka in bananas. The compound has shown a high level of activity, good persistence and crop tolerance. Besides powdery mildew, good control of rust, net blotch and Rhynchosporium diseases been indicated in cereals, together with a complementary activity against Septoria diseases. In 2017, the maximum residue limit (MRL) of spiroxamine established in Korea. According to Ministry of ood and rug afety) regulations, spiroxamine residues defined only parent compound. Thus, a analytical method is needed to estimate the residue level of the parent compound. The objective of this study was to develop and validate analytical method for spiroxamine in representative agricultural commodities. Samples were extracted with acetonitrile and partitioned with dichloromethane to remove the interfering substances. The analyte were quantified and confirmed liquid chromatograph-tandem mass spectrometer (LC-MS/MS) in positive-ion mode using multiple reaction monitoring (MRM). Matrix matched calibration curves were linear over the calibration ranges (0.0005~0.1 μg/mL) for the analyte in blank extract with coefficient of determination (r2) > 0.99. For validation purposes, recovery studies will be carried out at three different concentration levels (LOQ, 10LOQ, and 50LOQ) performing five replicates at each level. The recoveries 70.6~104.6% with relative standard deviations (RSDs) less than 10%. All values were consistent with the criteria ranges in the Codex guidelines (CAC/GL40, 2003) and MFDS guidelines. proposed analytical method be used as an official analytical method in the Republic of Korea.



LC-MS/MS를 이용한 농산물 중 살균제 Spiroxamine의 시험법 개발 및 검증

박신민, 도정아*, 임승희, 윤지혜, 박원민, 신혜선, 국주희1, 정형욱
식품의약품안전처 식품의약품안전평가원 식품위해평가부 잔류물질과
1식품의약품안전처 식품의약품안전평가원 식품위해평가부 영양기능연구팀

초록


    Ministry of Food and Drug Safety
    17161식위안001

    Spiroxamine(8-tert-butyl-1,4-dioxaspiro[4.5]decan-2- ylmethyl(ethyl) (propyl)amine)은 전 세계 80여 개국에 등 록되어 사용되고 있는 농약으로 우리나라에 2017년 신규 고시된 농약이다. Spiroketalamine계 살균제로 진균 활성 을 나타내며 균류의 부착기와 흡기의 형성을 막아 균류구 조에 손상을 주어 사멸시키거나 발아관의 성장을 저해하 는 기작을 갖고있는 것으로 알려져 있으며, 세포벽에 물 리 화학적으로 작용하여 uncinula포자를 사멸하는 기작 등 을 나타낸다. 특히 바나나의 잎에 변색된 얼룩점을 유발 하는 sikatoka병 방제에 대한 활성이 있는 것으로 알려져 있으며, 곡류의 흰가루병, 녹병, 망반병, Rhynchosporium 병, Septoria병의 방제 등에 이용한다1-3).

    2018년 5월 현재, spiroxamine은 EPA, 캐나다에서 모화 합물 및 aminodiole를 잔류물의 정의로 설정하고 있고, 유 럽, 미국, 일본 등에서는 모화합물만을 잔류물로 정하여 관 리하고 있다. 국외 잔류허용기준은 바나나 등 300여 종의 작물에 대하여 0.04~50 mg/kg 수준으로 설정되어 있다4-7). Spiroxamine의 분석법은 모화합물을 기준으로 GC-MS/MS, LC-MS/MS 등으로 분석한 사례가 보고되었으며, 시험법 의 경우 다성분분석을 목적으로 농산물, 축산물, 수산물 등을 분석한 문헌이 있으나, spiroxamine의 물리 화학적 특성을 고려해 개발된 단성분 시험법은 없는 실정이다8-12).

    Spiroxamine은 포도와 밀의 경우 체내대사과정에서 모 화합물의 total radioactive residue (TRR)가 53.8~76.0%이 며 잔류물은 0.2~9.0% 수준을 나타낸다고 보고되어있다3-4). 또한 안전성에 대한 평가결과 마우스, 랫드의 발암성 병 합시험에서 암수 모두 최고 농도군에서 발암성이 없는 것 으로 평가되었으며, 개 대상 1년 만성독성시험에서 도출 된 최대무독성용량(NOAEL, No Observable Adverse Effect Level) 2.47 mg/kg bw/day에 종간 및 개체 간 차이로 안 전계수 100을 적용하여 일일섭취허용량(ADI, Acceptable Daily Intake)은 0.025 mg/kg bw/day로 설정되었다13). 국내 의 경우 2016년 바나나와 포도에 대한 잔류허용기준이 신 설 요청되었으며, 독성시험 및 식물체내 잔류시험 결과에 따라 잔류물의 정의는 모화합물로서 기준이 신설되었다(식 품의약품안전처 고시 제2017-102호, 2017.12.15.). 따라서 본 연구에서는 수입 농산물 중 잔류할 수 있는 spiroxamine 에 대하여 기준 신설 식품인 바나나와 포도 뿐만 아니라 향후 기준신설 농산물이 늘어날 것에 대비함과 동시에, 사 용등록이 되지 않은 농산물에 오남용하는 것을 방지하기 위하여 모든 농산물에서 spiroxamine의 잔류허용기준 적 부 판정을 위한 시험법을 개발하고자 하였다.

    Materials and Methods

    시약 및 재료

    Spiroxamine (97.4%) 표준품은 bayer cropscience사에서 제공받아 사용하였다. 전처리용 시약으로 사용된 디클로 로메탄(dichloromethane), 아세톤(acetone), 아세토니트릴 (acetonitrile), 메탄올(methanol), 헥산(n-hexane) 및 에틸아 세테이트(ethyl acetate)는 HPLC 등급으로 Merck (Darmstadt, Germany)에서 구입하여 사용하였고, 염화나트륨(sodium chloride, NaCl)은 Wako (Osaka, Japan), 무수황산나트륨 (anhydrous sodium sulfate)은 Merck (Darmstadt, Germany), 수산화나트륨(sodium hydroxide, NaOH)과 암모늄 아세테이트(ammonium acetate)는 Sigma Aldrich (Buchs, Switzerland), SPE 카트리지(1 g, 6 cc)는 Waters (Milford, USA) 제품을 구입하여 사용하였다. 검체는 식품공전 농산 물분류에서 규정하는 대표농산물을 현미(곡류), 감자(서류), 대두(두류), 감귤(과일류), 고추(채소류)로 선정하고 시중에 서 판매하고 있는 무농약 농산물 각 1종을 구입하여 균질 화한 후 밀봉된 용기에 담아 −20°C이하에서 보관하고 실 험에 사용하였다.

    표준원액 및 표준용액의 조제

    Spiroxamine 1,000 μg/mL의 표준원액을 제조하여 아세 토니트릴에 희석하여 사용하였다. Matrix-matched calibration 을 위해 각 농산물 검체의 무처리 추출물 900 μL에 10 μg/ mL 표준용액 100 μL를 넣어 1.0 μg/mL 표준용액을 조제 한 뒤 무처리 추출액을 이용하여 단계적으로 희석하여 0.0005, 0.001, 0.005, 0.01, 0.02, 0.05 및 0.1 μg/mL의 90% 이상의 matrix가 첨가된 matrix-matched 표준용액을 조제 하였다. 표준원액과 표준용액은 모두 갈색병에 담아 4°C 에 보관하여 실험에 사용하였다.

    추출 및 정제

    균질화된 검체 10 g을 정밀히 달아 균질기 용기에 넣고 아세토니트릴 50 mL를 가하여 진탕기에서 10분간 진탕하 였다. 진탕 후 추출물을 여과지가 깔려있는 부흐너깔때기 로 흡인 여과한 뒤 아세토니트릴 20 mL로 잔사 및 용기를 씻어내려 앞의 여액과 합친 뒤 이를 40°C이하의 수욕 상 에서 감압 농축하였다. 농축 후 잔류물에 증류수 100 mL 를 가하여 녹인 후 1 N NaOH 용액을 천천히 가해 pH 7 로 조절하여 500 mL 용량의 분액여두에 옮기고 10 g의 NaCl을 더한 뒤 디클로로메탄 30 mL를 차례로 가하고 심 하게 흔들어 층이 완전히 분리될 때까지 정치시킨 후 디 클로로메탄 층을 무수황산나트륨에 통과시켜 감압농축플 라스크에 받는 과정을 2회 반복하였다. 이를 40°C 이하의 수욕 상에서 감압하여 용매를 모두 날려버린 후, 잔류물 에 헥산 10 mL를 가하여 녹였다. 이를 플로리실 카트리지 에 헥산 10 mL를 2~3 방울/초의 속도로 유출하여 버리고, 이어서 고정상 상단이 노출되기 전에 추출 과정으로부터 얻은 추출액 중 5 mL를 카트리지 상단에 넣어 1~2 방울/ 초의 속도로 유출시켜 버리고 고정상 상단이 노출되기 전 에 헥산 5 mL를 유출시켜 버린 후 아세톤/헥산(5/95, v/v) 10 mL를 유출시켜 받은 시험액을 감압농축플라스크에 모 았다. 이를 40°C 이하 수욕 상에서 감압농축 후 잔류물에 아세토니트릴을 가하여 최종부피 5 mL가 되게 한 뒤 멤 브레인 필터(nylon, 0.2 μm)로 여과한 후 시험용액으로 사 용하였다(Fig. 1).

    LC-MS/MS 분석조건

    Spiroxamine의 분석을 위하여 액체크로마토그래프-질량 분석기(Liquid Chromatograph-Tandem Mass Spectrometer, LC-MS/MS)를 사용하였고, 분석용 역상 칼럼인 C18 칼럼 을 선택하였으며 용리 방식은 10 mM 아세트산암모늄 수 용액과 10 mM 아세트산암모늄 포함 메탄올을 이동상으로 사용하는 기울기 용리 방식을 선택하였다. 각 대상 성분의 이온화법으로는 electro-spray ionization (ESI) 법의 positiveion mode를 사용하였다. LC-MS/MS 분석조건은 Table 1 과 같다.

    시험법의 검증

    Spiroxamine 시험법은 잔류물 분석에 관한 CODEX 가 이드라인21) (CODEX Alimentarius Commission, CAC/GL 40, 2003)의 잔류농약 분석 기준에 근거하여 직선성(linearity), 검출한계(limit of detection, LOD), 정량한계(limit of quantification, LOQ), 회수율(recovery), 재현성(reproducibility) 에 대해 유효성을 검증하였다. 직선성의 확인을 위 하여 spiroxamine을 무처리 시료 시험용액으로 희석하여 조제한 표준 용액 0.0005~0.1 μg/mL의 농도 범위에 대한 각각의 피크 면적을 이용하여 검량선을 작성하였고, 검량 선의 상관계수(coefficient of correlation, r2)를 구하였다. 또 한, 검출한계와 정량한계는 크로마토그램상에서 신호 대 잡음 비(S/N ratio) 각각 3, 10 이상으로 하였다. 시험법의 정확성 및 재현성을 평가하기 위하여 무처리 시료에 spiroxamine의 표준용액을 첨가한 후 분석하여 회수율을 구하였다. 처리농도는 정량한계, 정량한계의 10배, 정량한 계의 50배에 해당하는 농도로 수행하였으며 각각의 농도 및 시료에 대하여 5 반복으로 수행하여 평균과 상대표준 편차(relative standard deviation, RSD)를 계산하여 시험법 의 정확성과 정밀성 및 재현성을 평가하였다.

    Results and Discussion

    최적기기분석조건 확립

    Spiroxamine은 증기압이 4.0 × 10−3 Pa (25°C)이며 120°C 이상의 온도에서 불안정한 특성을 나타내며, Log Pow값이 산성 및 중성의 pH에서 1.28~2.79로 중간극성을 나타내는 화합물로 GC분석에 비해 LC 분석이 유리한 것으로 판단 하였다. 하지만 화합물 구조에서 conjugation 발색단이나 비공유 전자쌍을 갖는 포화화합물의 발색단을 가지고 있 지 않으므로 HPLC/UVD로의 분석이 불가할 것으로 판단 되었고, 이를 정확하게 확인하고자 HPLC의 PDA (Photodiode array) 검출기로 210 nm에서 360 nm까지 측정 파장을 스 캔한 결과 최대 흡수 파장(λ max)의 확인이 불가능하였다. 따 라서 선택성과 정확성을 확보하고자 Liquid Chromatograph- Tandem Mass Spectrometry (LC-MS/MS)를 분석기기로 최 종 선정하였다. LC-MS/MS는 HPLC에 비해 낮은 정량한 계를 나타내며, 선정된 분자량을 기준으로 분석되어 시료 의 간섭물질에 대해 영향을 받지 않으므로 정확성 및 선 택성이 높을 것으로 판단되었다.

    분석용 칼럼은 spiroxamine의 중간극성인 Log Pow값에 근거하여 극성도에 대해 넓은 스펙트럼을 갖고, 분배의 원 리로 분석물질이 분리되는 C18 역상 칼럼을 선택하였고, 10 mM 암모늄아세테이트 함유 메탄올과 10 mM 암모늄아 세테이트 함유 수용액을 이동상으로 사용하는 기울기 용 리 방식을 선택하였다. 이동상에 사용한 암모늄아세테이 트는 ion suppression 원리로 이동상의 pH를 spiroxamine 의 pKa인 6.9와 약 1.5 이상의 차이를 나타내도록 조절하 며, spiroxamine 분자의 이온화 억압을 유도하고 보다 높 은 감도의 선명한 피크를 얻기위해 사용하였다. 메탄올은 암모늄아세테이트에 대한 용해도가 100 mL당 7.89 g으로 높아, 완충용액으로서 사용에 용이하여 사용하였다14-15). 대 상 성분의 이온화법으로는 electro-spray ionization (ESI) 법의 positive-ion mode를 사용하였고 total ion chromatogram (TIC)과 mass spectrum을 통해 분석을 위한 최적 특성 이온을 선정하였다. 관측질량이 297.26인 표준용액 (0.5 μg/mL)을 일정한 속도(10 μL/min)로 질량 검출기에 직 접 주입한 결과 spiroxamine의 관측질량에 대해 [M+H]+형 태인 precursor ion 값을 298 mass으로 확인하였다. 이때 cone voltage의 변화에 따른 최적화 과정을 통해 30 V에서 최대 피크가 나타남을 확인하였으며, 최적화된 cone voltage 상태에서 분석의 선택성과 검출 강도를 극대화시키기 위 하여 MS/MS 분석 시 MRM (multiple reaction monitoring) mode로 분석하였다. Collision cell에서 collision energy를 조절하여 최적의 precursor/product ion pair를 선정하였고, 가장 좋은 감도를 보이는 product ion을 정량이온(quantification ion)으로, 다음으로 크게 검출되는 product ion을 정성이온(qualification ion)으로 설정하여 확인하였다. 분석 조건에서 선정된 특성 이온은 Table 2에 나타내었다. 또한 LC-MS/MS 분석 시에는 검체 중 추출성분에 의하여 대상 성분의 이온화 억압 또는 증강 현상이 나타날 수 있으므 로 검체별로 matrix-matched calibration 법에 준하여 정량 하였다16,17).

    추출 및 정제조건의 확립

    Spiroxamine은 Log Pow 값이 2.8~3.0인 화합물로 중간극 성을 띄며, 산성 조건에서 수용성으로 존재하고 중성 및 염기 조건에서 지용성으로 존재한다. Spiroxamine은 유기 용매에 대한 용해도가 높으며 추출 시 검체 내부로의 침투 성이 용이하도록 수용성 유기용매로 추출하고자 하였다. 보 편적으로 사용하고 있는 수용성 유기용매 중 아세톤과 메 탄올은 아세토니트릴에 비해 비극성 간섭물질에 대한 추 출률이 높고, spiroxamine의 회수율이 아세토니트릴 추출 시 충분히 효과적인 것으로 판단하여 아세토니트릴을 추 출 용매로 선정하였다. 추출 후 검체추출액 중 간섭물질 제거를 위해 디클로로메탄을 이용한 액-액 분배법을 적용 하였다. Ravelo-Pérez 등18)의 보고에서는 바나나에서 carbaryl 등 8종의 잔류농약 분석의 최적 조건을 설정하기 위해 변 수로 둔 조건 중 액-액 분배 시 염화나트륨의 농도를 15, 20, 25%로 두어 salting out을 유도한 결과 염화나트륨의 농도가 높아질수록 최적의 회수율을 나타내었다고 보고하 였고, Endo 등19)은 높은 추출효율을 얻기 위해 염을 물에 첨가하여 salting out을 유도한다고 보고하였다. 이는 액- 액 분배 시 포화수준의 염화나트륨 첨가를 통한 이온 강 도 증가로 수분층과 유기용매 층을 명확하게 분리하여 대 상 물질의 분배효율은 높이고, 시료 내의 극성 불순물이 유기용매 층에 전이되는 것을 최소화하기 위한 원리로 판 단되었으며 이를 적용하여 분배효율을 높였다. 또한 비극 성 유기용매인 디클로로메탄에 전이된 비극성 불순물을 정제하기 위해 고상 카트리지를 이용하여 정제하고자 하 였다. Żwir-Ferenc과 Biziuk20)에 따르면 정제 카트리지의 선택은 분석물질의 특성 및 검체 매트릭스 등에 따라 달 라지는데, 분석물질이 극성인 경우 순상카트리지를 이용 한 정제가 용이하며, 검체를 비극성 유기용매로 추출 또 는 분배했을 경우 유입된 비극성 간섭물질의 정제를 위해 극성 흡착기를 지닌 카트리지를 사용하여 비극성 간섭물 질은 통과시키고 상대적으로 극성인 분석물질을 정제한다 는 보고가 있다. 따라서 비극성 유기용매인 디클로로메탄 으로 액-액분배 후 유입된 비극성 간섭물질을 정제하고, spiroxamine이 중성 및 염기 조건에서 비해리 상태로 존 재하며 중간극성을 띄는 특성을 고려하여 추가적인 정제 를 위해 흡착원리를 따른 순상카트리지로서 hydroxyl기를 작용기로 갖는 플로리실(florisil), 실리카(silica) 카트리지를 이용하여 정제효율을 비교하였다. 용매는 spiroxamine에 대해 비교적 용해도가 높은 비극성 유기용매인 디클로로 메탄(극성지수: 3.1)과 극성용매를 혼합하여 분석 중 극성 물질에 대한 간섭을 최소화하기 위해 에틸아세테이트(극 성지수: 4.4) 용매조합으로 정제효율을 비교하였다. 플로 리실과 실리카 카트리지 실험 결과, 플로리실 카트리지의 경우 에틸아세테이트/디클로로메탄의 모든 분획에서 용출 되었으나 총 50.5%의 회수율을 확인하였으며 실리카 카 트리지의 경우 총 0.4%의 회수율을 확인하였다(Table 3). 따라서 다른 용매와의 정제효율을 비교하기 위해 상대적 으로 회수율이 높았던 플로리실 카트리지로 선정한 후 용 매 조성을 에틸아세테이트/헥산, 아세톤/헥산, 아세톤/디클 로로메탄으로 설정하여 회수율을 확인하였다. 하지만 모 든 용매 조성에서 최대 40.6%으로 낮은 회수율을 보였는 데, 이는 spiroxamine의 pKa에 근거하여 산성 혹은 중성의 pH일 때 이온화되어있는 상태이므로 일반적으로 중성의 화합물을 분석하는 흡착카트리지를 사용한 회수율이 낮은 것으로 판단되었다(Table 4). 따라서 spiroxamine의 추출효 율을 높이기 위해 농산물 시료인 감귤을 대상으로 아세토 니트릴로 추출 후 pH를 6-12로 조정하여 비교한 결과, pH 7인 중성조건에서 87.2%로 가장 높은 회수율을 나타내었 다. 한편 pKa그래프(Fig. 2)에서 pH가 높아질수록 해당 화 합물이 지용성으로 존재하는 것을 확인할 수 있었으나 중 성 조건에서 강염기 조건보다 높은 회수율을 나타내는 것 을 확인하였다. 따라서 본 시험법에서는 앞선 결과를 바 탕으로 아세토니트릴로 추출한 뒤 추출액의 pH를 7로 조 절하여 디클로로메탄으로 분배하는 방법을 적용하였다 (Table 5). 농산물 검체인 감귤을 아세토니트릴로 추출하 여 pH 7로 조정한 후 디클로로메탄으로 분배하여 정제를 진행하였다. 추출액을 헥산으로 재용해하여 플로리실 카 트리지에 용매 조성을 에틸아세테이트/헥산, 아세톤/헥산 으로 설정하고 회수율을 확인하였다. 실험결과, 에틸아세 테이트/헥산의 경우 에틸아세테이트/헥산(20/80, v/v), 에틸 아세테이트/헥산(30/70, v/v), 에틸아세테이트/헥산(40/60, v/v)의 분획에서 용출되어 각각 38.5, 28.8, 1.7%의 회수율 로 총 69.0%의 회수율을 확인하였다. 또한 아세톤/헥산의 경우 아세톤/헥산(10/90, v/v), 아세톤/헥산(20/80, v/v)의 분 획에서 용출되어 각각 72.1, 0.9%의 회수율로 총 73.0%의 회수율을 확인하였다. 따라서 아세톤/헥산으로 정제 시 로 딩에서 용출되지 않았으며 상대적으로 높은 회수율을 확 인하였으므로, 아세톤/헥산(10/90, v/v), 아세톤/헥산(20/80, v/v)의 분획을 세분화하여 정제회수율을 확인하여야 할 것 으로 판단하였다(Table 6). 더욱 효과적인 정제를 위해 플 로리실 카트리지를 이용하여 헥산에 재용해한 후 헥산, 아 세톤/헥산(2/98, v/v), 아세톤/헥산(5/95, v/v), 아세톤/헥산 (10/90, v/v), 아세톤/헥산(20/80, v/v)으로 세분화하여 각 용매 조성에 대해 5 mL씩 4개의 분획을 받아 실험을 진 행한 결과, 헥산 용매를 제외한 각기 다른 분획에서 용출 되었다. 그중 아세톤/헥산(5/95, v/v)의 첫 번째와 두 번째 분획(10 mL)에서 용출되어 78.6%로 가장 높은 회수율을 보였다(Table 7). 따라서 최종 정제법으로는 헥산으로 재 용해한 추출액 5 mL을 카트리지에 용출시킨 후 헥산 5 mL 로 씻어 버린 뒤 아세톤/헥산(5/95, v/v) 10 mL를 용출시 켜 받는 것으로 확립하였다.

    시험법의 검증

    선택성 및 직선성

    Spiroxamine의 선택성은 표준용액, 무처리 시료, 표준용 액을 첨가한 회수율 시료의 크로마토그램을 서로 비교하 여 평가하였다. 5종의 무농약 농산물 시료와 표준용액을 첨가한 시료를 확립된 시험방법에 따라 분석한 결과, 무 농약 시료 중 spiroxamine의 머무름 시간과 질량 대 전하 비(m/z)가 같은 어떠한 간섭물질도 검출되지 않았으므로 검체 중 spiroxamine의 분석을 위해 확립된 본 시험법의 높은 분리능과 선택성을 확인할 수 있었다. Spiroxamine 의 직선성을 확인하기 위하여 표준원액을 5종의 무농약 농산물 추출물로 희석하여 0.0005, 0.001, 0.005, 0.01, 0.02, 0.05 그리고 0.1 μg/mL 5 μL를 LC-MS/MS에 주입하여 분 석한 결과 모두 상관계수(r2)가 0.99 이상으로 높은 직선 성을 보였다(Fig. 3).

    검출한계와 정량한계

    Spiroxamine의 검출한계는 기기 크로마토그램 상에서 신 호 대 잡음 비(S/N ratio) 3 이상으로 결정하여 분석기기 의 최소검출량 0.0025 ng에 따른 검출한계는 0.0005 mg/ kg이었고, 정량한계는 신호 대 잡음 비(S/N ratio) 10 이상 으로 결정하여 분석기기의 최소검출량 0.005 ng에 따른 정량한계는 0.001 mg/kg이었다.

    시험법의 회수율

    시험법의 정확성을 평가하기 위하여 정량한계, 정량한계 의 10배, 정량한계의 50배 수준인 0.001, 0.01과 0.05 mg/ kg의 농도로 회수율 실험을 5회 반복하여 수행하였다. 시 험 결과 각 농도에서 평균 회수율은 70.6-104.6%이었고, 이때 상대표준편차도 9.9% 미만으로 조사되어 모든 분석 물질에 대한 높은 정확성, 재현성 및 효율성을 확인할 수 있었다. 이 결과는 잔류물 분석에 관한 CODEX 가이드라 인21)(CODEX Alimentarius Commission, CAC/GL 40, 2003)의 잔류농약 분석 기준에서 > 0.001 mg/kg ≤ 0.01 mg/ kg의 30%, > 0.01 mg/kg ≤ 0.1 mg/kg의 20%, > 0.1 mg/kg ≤ 1 mg/kg의 15%보다 낮아 기준에 적합함을 확인할 수 있었다(Table 8). LC-MS/MS를 이용하여 분석한 농산물 중 spiroxamine의 회수율 크로마토그램은 Fig. 4에 제시하였다.

    Acknowledgement

    본 연구는 식품의약품안전처의 연구사업 “2017년 식품 중 잔류농약 안전관리를 위한 위해평가 및 신규 시험법 확 립 연구(17161식위안001)”의 지원에 의해 수행되었으며, 이에 감사드립니다.

    Figure

    JFHS-33-296_F1.gif

    Flow chart for spiroxamine analysis.

    JFHS-33-296_F2.gif

    Structure and pKa graph of spiroxamine.

    JFHS-33-296_F3.gif

    Matrix-matched calibration curves of spiroxamine corresponding to: (A) hulled rice, (B) potato, (C) soybean, (D) mandarin and (E) green pepper.

    JFHS-33-296_F4.gif

    Representative MRM (quantification ion) chromatograms of spiroxamine corresponding to: 1. hulled rice, 2. mandarin, (A) standard solution at 0.01 mg/kg, (B) control, (C) spiked at 0.001 mg/kg, (D) spiked at 0.01 mg/kg, and (E) spiked at 0.05 mg/kg.

    Table

    Analytical conditions for the determination of spiroxamine

    Selected-ion of LC-MS/MS for spiroxamine

    Comparisons of SPE cartridge for spiroxamine analysis

    Comparisons of SPE cartridge for spiroxamine analysis

    Effects of pH for spiroxamine partition efficiency in mandarin sample

    Comparisons of elution solvents for spiroxamine analysis

    Comparisions of solvent ratio on spiroxamine elution efficiency

    Validation results of analytical method for the determination of spiroxamine in samples

    Reference

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