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ISSN : 1229-1153(Print)
ISSN : 2465-9223(Online)
Journal of Food Hygiene and Safety Vol.33 No.5 pp.412-415
DOI : https://doi.org/10.13103/JFHS.2018.33.5.412

Quantitative Cell Count of Vibrio vulnificus Cells Based on MPN-PCR Method

Yu-Mi Jang, Seul-Ki Park, Hee-Jin Jeong, Jang-Won Lee, Yohan Yoon1, Kwon-Sam Park2, Il-Shik Shin3, Young-Mog Kim*
Department of Food Science and Technology, Pukyong National University, Busan, Korea
1Department of Food and Nutrition, Sookmyung Women’s University, Seoul, Korea
2Department of Food Science and Biotechnology, Kunsan National University, Gunsan, Korea
3Department of Marine Food Science and Technology, Gangneung-Wonju National University, Gangneung, Korea
Correspondence to: Young-Mog Kim, Department of Food Science and Technology, Pukyong National University, 45 Yongsoro, Nam-gu, Busan 48547, Korea Tel: 82-51-629-5832 E-mail: ymkim@pknu.ac.kr
September 6, 2018 September 13, 2018 September 17, 2018

Abstract


The objective of this study was to establish a quantitative count method of Vibrio vulnificus cells. Plate count method is often used to count the number of V. vulnificus cells using thiosulfate citrate bile salts sucrose (TCBS) agar plate. However, this method is unsuitable for counting V. vulnificus cells due to growth inhibition and cell injuries in TCBS medium. In this study, we suggested a most probable number-polymerase chain reaction (MPNPCR) method using alkaline peptone water medium for the quantification of V. vulnificus. This MPN-PCR method showed 2 log higher cell number than TCBS agar plate method. Similar results were also found in the control using, Luria-Bertani agar containing 2% NaCl. Thus, this MPN-PCR method can be used a sensitive method for quantitative count of viable V. vulnificus cells in fish and shellfish samples.



MPN-PCR 방법을 이용한 Vibrio vulnificus 균수 정량분석

장 유미, 박 슬기, 정 희진, 이 장원, 윤 요한1, 박 권삼2, 신 일식3, 김 영목*
부경대학교 식품공학과
1숙명여자대학교 식품영양학과
2군산대학교 식품생명공학과
3강릉원주대학교 해양식품공학과

초록


    Ministry of Food and Drug Safety
    18162수산물542

    Vibrio vulnificus는 전 세계적으로 수인성 및 식품을 매 개로 패혈증을 발생시키며 사람뿐만 아니라 해수 및 어패 류의 육 등에서 분리가 가능하다. 2012년에서부터 2017년 까지의 국내 비브리오 패혈증 환자 발병 현황에 따르면, 매년 6월~10월경에 주로 발생하고 해수의 수온이 높아지 면서 발병자수가 늘어나며 9월에 가장 많이 발생한다1,2). 2012년에서부터 2017년의 최근 6년간 321명의 비브리오 패혈증 환자가 발생하였고 이 중 156명이 사망하여 48.6% 의 높은 치사율이 보고되었다1). 비브리오 패혈증은 주로 V. vulnificus에 오염된 어패류를 가열조리 없이 섭취하거 나 피부 상처 부위를 통한 감염에 의해 발생하며 일반적 으로 구토, 설사, 복통 등의 증상이 발생한다. 하지만, 간 질환과 당뇨병 등의 만성질환자, 장기 이식환자 및 면역 결핍환자의 경우 패혈성 쇼크에 의해 약 50%의 높은 치 사율을 일으키기 때문에 증상 발증 시 신속한 확인과 조 치가 필요하다1-3). V. vulnificus는 일반적으로 수온, 염도 및 pH 등의 환경 요인에 크게 영향을 받는 것으로 알려져 있다4-9). 수온의 경우 9°C에서 31°C 사이의 온도에서 생육 가능하고 18°C 이상일 때 최적으로 증식하며4,5), 5%에서 35% 사이의 염도에서 생육이 가능하고 25%의 염도에서 도 증식 한다6-8). 또한, pH 5~10의 조건에서 생육이 가능 하며 pH 7.8이 최적 조건으로 알려져 있다9).

    현재 해수 및 식품에서 Vibrio spp.을 분석하는데 사용하 는 방법으로는 thiosulfate citrate bile salts sucrose (TCBS) agar를 이용한 방법과 목적 유전자를 polymerase chain reaction (PCR)로 증폭하는 방법 등이 사용되고 있다10). 하 지만, TCBS는 Vibrio spp.의 선택적 분리배양에 사용되는 선택배지로 균수 정량 실험의 경우에는 적합하지 않다는 보고가 많다11,12). PCR을 이용한 목적 균의 검출 및 정량 의 경우는 단순히 시료 중에 존재하는 목적 DNA(사균의 DNA 포함)를 증폭하여 생균수 정량에 적합하지 않다고 보고되고 있다13). 이러한 단점들을 보완하기 위하여 alkaline peptone water (APW)에 증균 배양 후에 선택적 primer로 목적 유전자를 증폭하는 most probable number methodpolymerase chain reaction (MPN-PCR) 방법이 Vibrio spp. 균수 정량에 사용되고 있다14,15). 또한, V. vulnificus는 염, pH 그리고 온도 등의 환경인자 변화에 취약하여4-9), TCBS 를 이용한 균수 측정법으로는 정확한 균수 정량에 어려움 이 있다고 보고되고 있다11,12,16). 이에 본 연구에서는 심각 한 식중독 감염 사고를 발생시키는 세균인 V. vulnificus의 보다 정확한 균수 정량분석법을 확립하기 위하여 배양 배 지와 희석수 등의 변수에 따른 V. vulnificus 균수 변화를 분석하였다.

    Materials and Methods

    균주 및 배양 조건

    본 연구에서 사용한 균주는 한국미생물자원센터[Korea Collection for Type Cultures (KCTC), Daejeon, Korea]에 서 분양받은 V. vulnificus KCTC 41665 균주를 사용하였 으며, 2% NaCl이 첨가된 Luria-Bertani broth (LB; Difco, Detroit, MI)에 접종하여 35°C에서 12시간 동안 배양 후 사용하였다.

    일반균수측정법으로 진행한 V. vulnificus 균수 측정에는 LB-Na agar와 TCBS (Difco, Detroit, MI; pH 8.6 ± 0.2) agar가 사용되었고, 최확수법(MPN)에 따른 V. vulnificus 증 균에는 APW (pH 8.4 ± 0.2)가 사용되었다.

    증류수에 노출된 V. vulnificus 균수 측정에 대한 배지의 영향

    V. vulnificus를 증류수에 처리하여 배지별로 균수 변화 를 측정하였다. 100 mL 증류수에 1 mL의 V. vulnificus 배 양액(약 109CFU/mL)을 현탁하고 25°C에서 10분간 처리 하였다. 처리된 현탁액을 LB-Na agar와 TCBS agar에 도 말하여 균수를 측정하였다. 또한, MPN-PCR 방법을 이용 한 V. vulnificus 균수 측정은 단계별로 희석된 APW를 35°C 에서 12 ± 2시간 증균 배양한 후 PCR을 통해 V. vulnificus 양성 band를 확인하여 MPN 표로 균수를 측정하였다. PCR 에 사용된 V. vulnificus 분석용 primer와 PCR 조건은 Han and Ge (2015)의 보고에 따라 수행되었으며17), V. vulnificus 의 특이 primer (sense 5'-CAGCCGGACGTCGTCCATTTTG- 3'; antisense 5'-ATGAGTAAGCGTCCGACGCG T-3')를 사 용하였다. 또한 94°C에서 5분간 열 변성(denaturation) 후, 94°C에서 30초, 60°C에서 30초, 72°C에서 30초간 순환반 응(annealing)을 25 회 실시하고, 최종적으로 72°C에서 10 분간 신장반응(elongation)을 수행하였다.

    V. vulnificus 균수 측정에 대한 희석수의 영향

    V. vulnificus의 균수 분석에 미치는 희석수의 영향은 다 음과 같은 방법에 따라 진행하였다. V. vulnificus가 약 107CFU/mL 되도록 현탁된 해수 시료 1 mL를 9 mL의 0.1 M phosphate buffer saline buffer (PBS, pH 7.0)와 2% NaCl이 첨가된 PBS(이하 PBS-Na)에 각각 희석하였다. 각 단계별 희석용액은 LB-Na agar 및 TCBS agar를 이용하 여 평판도말법으로 35°C에서 12 ± 2시간 배양 후 생성된 집락수를 계수하였다. 또한, 위에서 기술한 MPN-PCR 방 법으로 V. vulnificus 균수를 측정하였다.

    통계처리

    본 연구에서 얻어진 모든 결과는 3회 반복하였으며, 그 결과는 평균 ± 표준편차로 나타내었다. 3회에 걸쳐 시행된 실험 결과들의 유의성 검정을 위하여 분산분석(ANOVA) 을 실시한 후, P < 0.05 수준에서 Duncan's multiple range test를 행하였고 SPSS (v.23.0, SPSS Ine., Chicago, USA) 통계프로그램을 이용하여 통계 분석을 실시하였다.

    Results and Discussion

    Vibrio spp. 균의 생존과 증식에 염이 필요하며 염의 농 도가 낮을 경우 세포가 손상된다고 보고되고 있다16,18). 이 에 본 연구에서는 증류수에 V. vulnificus를 노출시킨 후 배 지에 따른 균수변화를 분석하였다(Table 1). 증류수에 10 분간 처리된 V. vulnificus는 처리하지 않은 대조구와 비교 하였을 때 균수의 감소가 나타났다. 이는 다른 연구자들 의 보고와 마찬가지로 염이 없는 조건에서 V. vulnificus 세 포가 손상되어 사멸되기 때문으로 판단된다18). 하지만, 배 지별로 균수의 차이가 관찰되었다. LB-Na agar 및 TCBS agar에서는 각각 2.25 ± 0.56 및 0.13 ± 0.23 log CFU/mL의 균수가 측정되었으나, APW를 이용한 MPN-PCR의 경우 4.49 ± 0.96 log MPN/100 mL로 TCBS agar와 비교하였을 때 mL 당 2 log 이상 높은 균수가 측정되었다. 이러한 결 과는 증류수 처리 후에 일부의 V. vulnificus 세포는 사멸 상태가 아니라 손상된 상태로 존재하며 손상된 V. vulnificus 세포는 선택성이 강한 TCBS에서 증식이 잘 되지 않지만 APW를 이용한 MPN-PCR의 경우 증균 배양에 의해 손상 된 세포가 회복되기 때문에 LB-Na agar와 비슷한 균수가 측정된 것으로 생각된다16,18). 다른 연구자들도 손상된 Vibrio spp.의 경우 TCBS agar 등의 선택배지에서 증식이 잘 되 지 않는다는 연구 결과를 보고하고 있다11,12,16,18).

    이상의 결과는 TCBS agar와 같은 선택배지는 균수 정 량 분석용 배지로는 적합하지 않고 APW를 이용한 MPNPCR 방법이 손상된 V. vulnificus 균수 정량에도 유용하게 적용될 수 있다는 것을 제시하고 있다16,18). 또한, 다양한 균들이 오염되어 있는 어패류 등의 시료에서 V. vulnificus 균수 정량분석에 MPN-PCR 방법이 유용하게 적용될 수 있다는 것을 의미한다. 이에 본 연구에서는 어패류 등의 시료에서 MPN-PCR을 이용한 V. vulnificus 균수 정량분석 법을 개발하기 위한 기초 자료를 얻기 위하여 희석수의 영향에 대해 조사하였다(Table 2). V. vulnificus 균수 측정 에 PBS를 희석수로 사용하였을 때, LB-Na 및 TCBS에서 각각 7.06 ± 0.44 및 3.74 ± 0.79 log CFU/mL의 균수가 측 정되었다. 반면, APW을 이용한 MPN-PCR의 경우 희석수 로 PBS를 사용하였을 때 7.69 ± 1.13 log MPN/100 mL로 TCBS에 비하여 mL 당 2 log 이상 높은 균수가 측정되었 다. PBS-Na를 희석수로 사용한 경우, LB-Na agar 및 TCBS agar에서는 각각 7.88 ± 0.05 및 5.42 ± 0.18 log CFU/mL의 V. vulnificus 균수가 측정되었고, MPN-PCR의 경우 9.07 ± 0.26 log MPN/100 mL로 나타났다. PBS를 희석수로 사용하 였을 때와 유사하게 APW을 이용한 MPN-PCR의 경우, TCBS agar에서의 결과와 비교하였을 때 V. vulnificus 균 수가 mL 당 2 log 이상의 높은 균수가 측정되었다. 또한, MPN-PCR의 방법을 이용하여 측정된 V. vulnificus 균수는 LB-Na agar에서 측정된 균수와 유사하게 mL 당 약 7 log 의 균수가 측정되었다. 이상의 결과를 종합해 보면, V. vulnificus 균수 측정에 2% NaCl이 첨가된 PBS-Na를 희 석수로 사용하였을 때가 일반 PBS를 사용하였을 때보다 유의적으로 높은 균수가 측정되었다(Table 2). 이는 균의 생존과 증식에 염 농도의 영향을 많이 받는 V. vulnificus 의 특성 때문인 것으로 판단되며, 다른 연구자들도 V. vulnificus는 염의 영향을 크게 받는다고 보고하고 있다18,19).

    이상에서 기술한 것처럼 TCBS agar는 Vibrio spp.의 분 리를 위한 선택배지로 다른 균의 증식을 억제하는 선택성 이 강하여 손상된 세포의 경우는 해당 배지에서 배양이 잘 되지 않는 것으로 판단된다11,12,18). 본 연구에서 얻어진 결과를 종합해 보면, NaCl이 포함된 PBS 희석수와 APW 배지를 이용한 MPN-PCR 방법이 V. vulnificus 균수 정량 분석에 유용한 것으로 분석되었다. 향후, 본 연구에서 제 시된 V. vulnificus 균수 정량분석 방법은 해수뿐만 아니라 어패류 등의 시료에서 V. vulnificus의 정량분석에 유용하 게 사용될 것으로 기대된다.

    Acknowledgement

    이 논문은 2018년도 식품의약품안전처에서 시행한 용역 연구 개발과제의 연구개발비 지원(18162수산물542)에 의 해 수행되었음.

    Figure

    Table

    Effect of culture medium on cell count of Vibrio vulnificus by the treatment of distilled water

    Effect of dilution buffer and culture medium on cell count of Vibrio vulnificus

    Reference

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