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ISSN : 1229-1153(Print)
ISSN : 2465-9223(Online)
Journal of Food Hygiene and Safety Vol.33 No.6 pp.516-520
DOI : https://doi.org/10.13103/JFHS.2018.33.6.516

Characterization of the Bacteriocin from Enterococcus faecium CJNU 2008

Souk-Jin Seo, Jung-Mo Yang, Gi-Seong Moon*
November 26, 2018 December 5, 2018 December 12, 2018

Abstract


Bacteriocin is a proteinaceous compound produced by microorganisms showing antimicrobial activities. In this study, the physicochemical properties of the bacteriocin produced by Enterococcus faecium CJNU 2008 strain were characterized. Partially purified bacteriocin showed stabilities against heat treatments at 100°C for 30 min and 121°C for 15 min and against solvents treatments such as methanol, ethanol, acetone, acetonitrile and chloroform. The bacteriocin also exhibited stabilities against lipase and α-amylase treatments but the stability was abolished at protease treatment, indicating that the antimicrobial agent from E. faecium CJNU 2008 was a proteinaceous bacteriocin. The bacteriocin also showed bactericidal mode of action against Listeria monocytogenes. The molecular mass of the bacteriocin was estimated to be under 6.5 kDa by a tricine-SDS-PAGE analysis. The bacteriocin was purified by HPLC. Further studies toward biochemical analysis of the bacteriocin are needed in near future.



Enterococcus faecium CJNU 2008 균주 생산 박테리오신의 특성 규명

서숙진, 양정모, 문기성*

초록


    Korea Institute of Planning and Evaluation for Technology in Food, Agriculture, Forestry and Fisheries
    117060032HD040

    캐피어(Kefir)는 유산균, 효모 등의 복합발효에 의해 제 조되는 발효유 중 하나로 세계적인 장수 지역으로 알려진 코카서스 지방에서 유래된 전통식품이며 그 지역 사람들과 수천 년 동안 함께 해왔다1). 캐피어는 미넬랄, 비타민, 필 수 아미노산 등 인체에 필요한 다양한 영양소들을 포함하 고 있다2). 캐피어 1 mL당 107-10개의 미생물들이 서식하고 있으며3), 유산균과 효모를 포함하여 초산균 등이 주 균총 을 이루고 있다4). 캐피어의 미생물학적 분석 외에도 기능 성 관련 많은 연구들이 진행되어 왔다5).

    박테리오신(Bacteriocin)은 박테리아에 의해 분비되는 항 균성 단백질로서 안전성 등의 이유로 유산균이 생산하는 박테리오신에 대한 연구가 활발하다6). 박테리오신은 유전 자 발현 과정을 통해 리보솜에서 단백질로 합성되며7), Riley와 Wertz8)는 많은 수의 미생물 균종들이 박테리오신 을 생산하고 있다고 제안하였다. 박테리오신의 항균활성은 구조에 따라 다양하며 좁은 항균스펙트럼 혹은 넓은 항균 스펙트럼을 가진 박테리오신들이 존재한다9). 박테리오신 의 분류는 학자마다 다소의 차이는 있으나10), 주로 단백질 의 크기, 열 안정성 또는 분비 기작에 따라 Class I-III로 구분된다9). 그 중에서 구조적인 안정성으로 인해 Class I 과 Class II에 대한 학자들의 관심이 높으며 Class I은 lanthionine 및 3-methyllanthionine이 함유된 5 kDa 미만의 작은 펩타이드로 구성 되어 있고11), class II는 class I과 달 리 lanthionine을 가지고 있지 않으며 약 10 kDa 미만의 작 은 크기를 가지고 있어 열에 대한 안정성이 높다12). Class III는 분자량이 10 kDa 이상이며 열에 대한 안정성이 떨어 진다13).

    최근에는 박테리오신을 활용하여 식품보존제, 차세대 항 생제 및 암 치료제 등의 개발을 위한 연구들이 활발하게 진행되고 있다14). 본 연구에서는 선행연구15)를 통하여 캐 피어로부터 분리한 E. faecium CJNU 2008 유래 박테리오 신의 일부 특성을 규명하였으며 그 결과를 보고하고자 한다.

    Materials and Methods

    사용균주 및 배양

    박테리오신 생산 E. faecium CJNU 2008 및 지시균 L. monocytogenes KCTC 3569는 MRS 배지(BD, Sparks, MD, USA)에서 배양하였으며 작용 양상(mode of action) 시험을 위해서는 Peptone (BD, Sparks, MD, USA)이 사용 되었다.

    박테리오신 안정성 조사

    박테리오신이 포함된 E. faecium CJNU 2008의 배양상 등액을 아세톤추출법16)으로 부분 정제한 후 이를 열처리, 유기용매 및 효소에 대한 안정성 시험에 사용하였다. 부 분 정제 박테리오신의 조제는 E. faecium CJNU 2008 균 주를 37°C에서 12시간 배양한 후 원심분리(4°C, 8000 rpm, 20분)하여 상등액을 회수하였다. 상등액은 10 N NaOH를 이용하여 중화(pH 7.0)시키고 membrane filter (0.22 μm; Sartorius Co., Göttingen, Germany)로 제균하였다. 상등액 100 mL에 아세톤 300 mL을 혼합한 다음 −20°C에서 3시 간 동안 방치하면서 30분 간격으로 교반하였으며 이후 원 심분리(4°C, 9,000 rpm, 30분)하여 상등액 회수 후 회전식 감압 농축기(Eyela, Tokyo, Japan)로 농축하였다. 이렇게 조제된 부분 정제 박테리오신의 열 안정성 시험은 60°C, 80°C, 100°C에서 각각 15분, 30분, 60분 및 121°C에서 15 분 동안 방치 후 잔존하는 박테리오신 활성을 측정하였다. 박테리오신 활성은 한천확산법(agar diffusion method)으로 실시하였으며 활성의 크기는 임의단위(AU/mL)를 사용하 여 나타내었다. 즉, 시료원액을 2배씩 연속해서 희석한 다 음 활성을 나타내는 최고 희석배수의 역수를 취하여 그 값으로 하였다17). 항균활성 시험의 지시균은 L. monocytogenes KCTC 3569를 사용하였으며 MRS 배지, 37°C 에서 12시간 배양한 균 배양액을 5 mL MRS 배지(0.7% agar 함량)에 섞고 현탁한 다음 MRS 고체배지 위에 부었 다. 이를 30분간 방치한 다음 박테리오신 시료 2 μL를 그 위에 점적한 후 배양하면서 생육저해환(inhibition zone)을 관찰하였다. 유기용매에 대한 박테리오신의 안정성을 확 인하기 위해 메탄올(Honeywell B & J, Ulsan, Korea), 에 탄올(Honeywell B & J), 아세톤(Honeywell B & J), 아세 토니트릴(Honeywell B & J) 및 클로로포름(Avantor Performance Materials, Center Valley, PA, USA)을 사용하였 으며 박테리오신 용액 100 μL와 유기용매 100 μL를 섞은 다음 37°C에서 2시간 반응 후 잔존 활성을 측정하였다. 마 지막으로 효소에 대한 안정성 시험은 Protease (Tokyo chemical, Tokyo, Japan), Lipase (Tokyo chemical) 및 α- Amylase (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA)를 사용하였으며, 박테리오신 용액 50 μL에 1 uint의 효소를 첨가한 후 37°C 에서 1시간 반응시킨 뒤 잔존 활성을 측정하였다. 측정 전 에 처리액을 100°C에서 5분간 가열하여 효소를 불활성화 시켰다.

    박테리오신 작용 양상

    E. faecium CJNU 2008로부터 생산된 박테리오신의 작 용 양상을 L. monocytogenes KCTC 3569를 지시균으로 사 용하여 시험하였다. 즉, 30 mL 펩톤수(0.1%, w/v)에 지시 균을 1% 접종하고 박테리오신 용액을 각각 0, 10, 50, 100 AU/mL되게 첨가한 후 2시간 동안 배양하면서 지시균의 생 균수(Log CFU/mL)를 MRS 고체배지 상에서 측정하였다.

    박테리오신 분자량 측정

    부분 정제된 박테리오신의 분자량 확인을 위하여 Tricine- SDS-PAGE (tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)를 실시하였으며 15% 겔을 사용하여 110 V에서 1시간 30분간 전기영동 한 후 bioassay를 수행 하였다18,19). 즉, 전개된 겔을 적당한 크기로 자른 후 증류 수에서 2시간 동안 세척하였다. 세척한 겔을 MRS 고체 배지에 올리고 그 위에 지시균(L. monocytogenes)이 포함된 5mL의 MRS 배지(0.7% agar 함량)를 부었다. 37°C에서 12 시간 배양 후 생육저해환을 관찰하여 박테리오신의 위치 를 확인하였다.

    박테리오신 정제

    E. faecium CJNU 2008 균주로부터 생산된 박테리오신 의 부분정제를 위해 앞서 언급한 아세톤추출법16)을 이용 하였으며 이를 HPLC (high performance liquid chromatography) 정제에 사용하였다. HPLC 정제를 위해 ACE 5 C18 (4.6 × 150 mm) 컬럼(Advanced Chromatography Technologies, Aberdeen, UK)을 사용하였으며 이동상 A용매(물 + 0.1% TFA)와 B용매(아세토니트릴 + 0.1% TFA)를 조합 하여 60분 동안 0-10분 A용매 100%, 10-50분 A용매 100% → B용매 100%, 50-60분 B용매 100%의 농도기울기를 적 용하였다. 유속은 1 mL/분으로 유지시켰으며 1 mL씩 분획 하여 동결건조하였다. 분획에서의 박테리오신 활성은 각 각의 분획을 20 μL 3차 증류수에 녹인 다음 앞서 언급한 한천확산법으로 확인하였다.

    Results and Discussion

    박테리오신 안정성 조사

    E. faecium CJNU 2008 균주의 부분정제 박테리오신에 대한 열 안정성을 시험한 결과, 100°C, 60분 열처리를 제 외한 모든 열처리 조건에서 안정성을 보였다(Table 1). 특 히, 멸균 조건인 121°C, 15분에서도 박테리오신 활성 소 실이 전혀 없어 열에 대한 안정성이 아주 우수한 것으로 확인되었다. 유기용매에 대한 안정성 시험을 위해 메탄올, 에탄올, 아세톤, 아세토니트릴 및 클로로포름을 사용하였 으며 사용한 모든 유기용매에 대해서 안정성을 나타내었 다. 마지막으로 효소(Protease, Lipase 및 α-Amylase)에 대 한 안정성을 시험한 결과 Lipase와 α-Amylase 처리에서는 박테리오신의 활성이 유지된 반면 Protease 처리에서는 활 성이 완전히 소실되는 것을 확인하였다(Fig. 1). 이 결과 는 E. faecium CJNU 2008 균주가 생산하는 항균물질이 단백질성의 박테리오신임을 추가적으로 증명하는 것이다.

    박테리오신 작용 양상

    E. faecium CJNU 2008 균주가 생산하는 박테리오신의 작용 양상(정균 혹은 살균)을 확인하였다. 지시균으로 병 원성 세균인 L. monocytogenes 균주를 사용하여 작용 양 상을 시험한 결과, 박테리오신 처리 시 생균수가 감소하 는 것을 확인하였으며 박테리오신 농도가 높을수록 감소 율이 증가하였다(Fig. 2). 다만, 최종농도 50과 100 AU/ mL 사이에서는 큰 차이를 보이지 않았다. 이러한 결과는 E. faecium CJNU 2008 균주가 생산하는 박테리오신의 작 용 양상은 정균(bacteriostatic)이 아닌 살균(bactericidal)작 용을 나타내고 있음을 의미하는 것이다. 선행연구15)에서 E. faecium CJNU 2008 균주가 생산하는 박테리오신은 L. monocytogenes 균주를 포함하여 Staphylococcus aureus, Lactobacillus acidophilusLeuconostoc mesenteroides 균 주에 대한 항균활성을 보인 반면 Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pediococcus acidilactici 균주 등에 대해서는 항균 활성을 보이지 않았다.

    박테리오신 분자량 측정

    부분 정제된 박테리오신의 분자량 확인을 위하여 Tricine- SDS-PAGE를 실시하였다. 분석 결과, 분자량이 작아 염색 액(Coomassie Brilliant Blue G, Daejung, Siheung, Korea) 으로 염색한 겔에서는 단백질 밴드(band)의 확인이 어려 웠으며 동시에 수행한 bioassay에서만 특정 위치에서 생육 저해환(inhibition zone)이 확인되었다. 이 생육저해환은 박 테리오신에 기인하는 것으로 추정되며 그 위치는 6.5 kDa 이하로 나타났다(Fig. 3).

    박테리오신 정제

    E. faecium CJNU 2008 균주가 생산하는 박테리오신을 정제하기 위해 아세톤추출법16)으로 부분정제 한 후 HPLC 에 적용하였다. HPLC 분석 결과, 29분대에서 단백질 피 크(peak)가 확인되었으며 그 분획(fraction)은 사용한 지시 균(L. monocytogenes KCTC 3569)에 대하여 항균활성을 나타내었다(Fig. 4). 이렇게 정제된 박테리오신은 앞으로 생화학적인 분석 등에 활용할 계획이다.

    지금까지 Enterococcus 속 균주가 생산하는 다양한 박테 리오신에 대한 특성이 규명되었다20). 대부분 분자량이 작 은 class II에 속하는 박테리오신이며 일부 lantibiotics와 열에 약한 분자량이 큰 박테리오신이 포함된다. 특히 class II에 속하는 환형(circular)의 박테리오신인 enterocin AS- 48은 그람 양성 및 음성 세균 모두에 항균활성을 가지며 화학보존제(오일, 페놀화합물) 및 물리화학적 처리와 병용 했을 때 그 효과를 극대화 할 수 있다21). 현재까지 케피어 에서 분리된 Enterococcus 속 균주가 생산하는 박테리오 신에 대한 연구는 극히 드물다. 본 연구에서 규명한 E. faecium CJNU 2008 균주가 생산하는 박테리오신은 안정 성이 우수한 특성(class I 혹은 class II)을 나타내고 있어 천연보존제로서 산업적 활용도가 클 것으로 판단된다.

    국문요약

    박테리오신은 미생물이 생산하는 단백질성의 항균물질 이다. 본 연구에서는 Enterococcus faecium CJNU 2008 균 주로부터 생산되는 박테리오신에 대한 일부 특성을 규명 하였다. 부분 정제 박테리오신은 열처리(100°C 30분, 121°C 15분) 및 유기용매(메탄올, 에탄올, 아세톤, 아세토니트릴, 클로로포름)에 대한 안정성이 우수하였으며 효소처리의 경 우 Lipase와 α-Amylase에 대해서는 안정하였으나 Protease 처리에서 활성이 소실되었다. 이는 E. faecium CJNU 2008 균주가 생산하는 항균물질이 단백질성의 박테리오신임을 추가적으로 증명하는 것이다. 병원성 세균인 Listeria monocytogenes 균주를 지시균으로 사용했을 때 박테리오신은 살균(bactericidal)의 작용양상을 보였다. Tricine-SDS-PAGE 를 이용한 박테리오신의 분자량은 6.5 kDa 이하로 확인되 었다. 부분 정제된 박테리오신을 이용하여 HPLC법을 활 용한 정제를 수행하였으며 크로마토그램 상에서 단일 피 크를 얻었을 수 있었다. 앞으로 정제된 박테리오신은 생 화학적 분석 등에 활용할 계획이다.

    Acknowledgement

    본 결과물은 농림축산식품부의 재원으로 농림수산식품 기술기획평가원의 고부가가치식품기술개발사업의 부분적 인 지원을 받아 연구되었음(과제번호 117060032HD040).

    Figure

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    Stability of the partially purified bacteriocin of E. faecium CJNU 2008 for enzymes. 1: Control (no treatment); 2: Protease; 3: Lipase; 4: α-Amylase. For antimicrobial activity test, samples were loaded on MRS agar plate which was overlaid with the indicator strain (L. monocytogenes KCTC 3569).

    JFHS-33-516_F2.gif

    Bactericidal activity of partially purified bacteriocin from E. faecium CJNU 2008 against L. monocytogenes. The bacteriocin of 10, 50, or 100 AU/mL was used for the test.

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    Tricine-SDS-PAGE of partially purified bacteriocin of E. faecium CJNU 2008. M: Size marker (Ultra Low Range Molecular Weight Marker, Sigma-Aldrich, USA); 1: Bioassay for the bacteriocin (indicator: L. monocytogenes KCTC 3569).

    JFHS-33-516_F4.gif

    Purification of the bacteriocin of E. faecium CJNU 2008. A: HPLC chromatogram for solvent; B: HPLC chromatogram for partially purified bacteriocin; C: Bacteriocin activity of the fractions from 26-30 min.

    Table

    Stability of the partially purified bacteriocin of E. faecium CJNU 2008

    Reference

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