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ISSN : 1229-1153(Print)
ISSN : 2465-9223(Online)
Journal of Food Hygiene and Safety Vol.34 No.2 pp.183-190
DOI : https://doi.org/10.13103/JFHS.2019.34.2.183

Anti-Cancer Effect of Ursolic Acid in Melanoma Cell A375SM and A375P

Joong-Seok Woo, Na-Won Kim, Jin-Gyu Lee, Jae-Hyuk Kim, Da-Young Lim, Shin-Woo Kang, Sung-Hyun Kim, Eun-Seon Yoo, Jae-Han Lee, So-Hee Han, Young-Seok Park, Byeong-Soo Kim, Sang-Ki Kim, Byung-Kwon Park, Ji-Youn Jung*
Department of Companion and Laboratory Animal Science, Kongju National University, Yesan, Korea
Correspondence to: Ji-Youn Jung, Department of Companion and Laboratory Animal Science, Kongju National University, Yesan-eupYesan-gun Chungcheongnam-do, 32439, Korea Tel: 82-41-330-1526, Fax:82-41-330-1529 E-mail: wangza@konghu.ac.kr
December 21, 2018 January 16, 2019 February 16, 2019

Abstract


Ursolic acid is recognized for various effects such as anti-cancer, antioxidant, and anti-inflammatory activity. In this study, we confirmed the anti-cancer effect of ursolic acid on human melanoma cancer cells, A375SM and A375P. Survival rate of the melanoma cells was confirmed by MTT assay and the proliferation rate was confirmed by wound healing assay. The rate of apoptotic bodies was confirmed by DAPI staining, and apoptosis rate was confirmed by flow cytometry. The induction of apoptosis protein was examined by western blotting according to the concentration of ursolic acid in melanoma cells. The survival and proliferation rates of melanoma cells were decreased according to the treatment concentrations of ursolic acid. DAPI staining showed that chromosomal condensation of melanoma cells was increased with increasing concentrations of ursolic acid, and increased apoptosis rate of melanoma cells by ursolic acid was confirmed by flow cytometry. We also confirmed by western blotting that cleaved-PARP and Bax were increased and Bcl-2 was decreased at 12 μM concentration of uricolic acid in melanoma cells. This study was carried out at low concentrations of ursolic acid, 0 to 20 μM, and analyzed 24 h after treatment. As a result of this study, it is thought that ursolic acid has the anti-cancer effect through the regulation of apoptosis-related proteins in melanoma cells A375SM and A375P.



Ursolic acid의 악성 흑색종 세포주 A375SM과 A375P에서의 항암효능

우 중석, 김 나원, 이 진규, 김 재혁, 임 다영, 강 신우, 김 성현, 유 은선, 이 재한, 한 소희, 박 영석, 김 병수, 김 상기, 박 병권, 정 지윤*
공주대학교 특수동물학과

초록


    National Research Foundation of Korea
    NRF-2017R1A2B4005516

    사람의 피부는 자외선에 의한 손상과 자유라디칼 등 내 부 혹은 외부의 요인으로부터 발생하는 다양한 자극으로 인한 지속적인 손상을 받게 된다1). 특히 이러한 자외선에 노출되거나 산화 스트레스(oxidative stress)로 인한 손상은 노화의 진행과 종양 발생의 원인이 되는 것으로 알려져 있다2,3).

    한편 인간의 기대수명이 꾸준히 증가하면서 피부 손상 이 축적된 고령의 인구가 증가하고, 이와 더불어 악성흑 색종(malignant melanoma)의 발병률 및 사망률 또한 꾸준 히 증가하고 있다4,5). 건강보험심사평가원 2017년 연령별 진료 인원 통계자료에 의하면 60대가 37%(980명)로 가장 많았으며 70대가 25%(919명) 50대가 22%(806명) 순으로 흑색종은 대부분 노령인구에서 주로 발병하고 있다. 또한 악성흑색종으로 판정을 받은 인원은 2014년 3,267명에서 2015년 3,258명으로 소폭 감소했으나, 2016년 3,484명 2017 년 3,662명으로 꾸준히 증가하는 추세이다6). 사람의 피부 에 존재하는 멜라닌 세포의 악성화로 인해 발생하는 피부 암인 악성흑색종은 모든 피부암의 4% 정도이지만 사람의 피부암으로 인한 사망원인의 80% 이상을 차지한다. 또한 흑색종이 전이된 경우 10년 후 생존율은 10% 미만으로 나타난다7,8). 이러한 악성흑색종은 수술이나 항암요법 등 의 치료가 쉽지 않고, 계속되는 의학의 발달에도 약물저 항성과 높은 독성으로 치료가 어렵다. 때문에 오랜 시간 동안 많은 연구자들은 자연에서부터 새로운 천연 항암물 질을 발견하기 위해 연구하고 있다9-11).

    자연적으로 발생하는 식이 및 비식이 식물의 화학 물질 은 다양한 암 예방과 치료에 엄청난 잠재력을 가지고 있 다. 인도와 중국에서 전통적으로 의약 목적으로 사용되는 식물의 화학 물질 중 가장 큰 그룹인 terpenoid는 다양한 약리 효과를 가지고 있다. 이는 특히 식물에서 발생하는 2차 대사산물 중 대부분의 유기체로 알려져 있다12,13). 그 중 하나인 우르솔릭산(ursolic acid)은 로즈마리(rosemarinus officinalis), 비파나무(eriobotrya japonica), 히더(calluna vulgaris), 바질(ocimum sanctum) 등의 약재 식물들의 잎과 꽃, 그리고 열매 등으로부터 분리되는 pentacyclic triterpenoid로서 항염증 및 항암 작용에 탁월한 효과가 있 는 것으로 보고되었다14). 우르솔릭산은 종양세포에 대해서 세포자멸사(apoptosis) 유도, 항전이(anti-metasis), 항혈관신 생(anti-angiogenesis) 등의 항암기능을 가지고 있는 것으로 밝혀져 있다15,16). 또한 우르솔릭산은 그의 이성질체인 oleanolic acid와 함께 많은 야채, 허브 및 여러 가지 식물에 서 발견되는 pentacyclic triterpenoid계 사포닌의 일종으로 항염효과, 항암효과 및 항균 특성이 있고 특히, 피부에 있 어서 노화 방지 및 주름 개선 효과 등이 알려져 있어 일부 외용제 및 복용제 그리고 화장품 등에 사용되어 왔으며17,18), 기존 연구에서는 우르솔릭산을 활용하여 대장암19), 방광암, 췌장암20), 전립선암21), 간암, 위암22) 등을 억제하는 효능이 밝혀져 있다. 따라서 본 연구에서는 기존 연구에서는 연 구된 바 없는 인간 유래 흑색종 세포 중 전이성이 높은 A375SM 세포와 전이성이 낮은 A375P 세포에서도 우르 솔릭산이 세포자멸사를 유도하는지 알아보고자 하였다.

    Materials and Methods

    세포 및 실험재료

    흑색종 세포(A375SM, A375P human melanoma cells)는 한국 세포주 은행(KCLS, Korean cell Line Bank, Seoul, Korea)에서 구입하였다. DMEM, FBS (fetal bovine serum) 은 Welgene (Gyeongsan, Korea)에서 구입하였다. penicillin-streptomycin, trypsin-EDTA은 Gibco BRL (Grand Island, NY, USA)에서 구입하였다. Ursolic acid (Fig. 1)와 본 실험에서 사용한 일반적인 시약은 Sigma- Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. Ursolic acid는 DMSO (dimethyl sulfoxide)에 희석하여 사용하였다. FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit는 BD Pharmingen (San Diego, CA, USA)에서 구입하였다. Antirabbit IgG와 anti-Bax, anti-β-actin, anti-PARP은 Cell signaling Technology (Cell signaling Technology, Danvers, MA, USA)에서 구입하였으며 anti-Bcl-2는 Novus Biologicals (St. Colorado, Littleton, USA)에서 구입하였다.

    세포배양

    A375SM과 A375P는 5% FBS, 1% streptomycinpenicillin을 첨가한 DMEM 배지를 사용하여 37ºC, 5% CO2 가 유지되는 incubator에 배양하였다. 플라스크에 세포가 80~90% 정도 되었을 때 PBS를 사용하여 세포를 세척 후 trypsin-EDTA를 처리하여 계대하였다. 배지는 2~3 일마다 교환해 주었다.

    세포 생존율 측정

    세포 생존율은 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay를 통하여 측정하였다. A375SM과 A375P를 96-well plate의 각 well에 2×104 cell/ mL씩 분주하여 DMEM 배지에서 24 시간 동안 37ºC, 5% CO2가 유지되는 incubator에 배양하였다. 그 후 ursolic acid 를 0, 4, 8, 12, 16, 20 μM로 처리하여 24 시간 동안 incubator에 배양하였다. 24 시간 후 PBS에 1 mg/mL로 녹 인 MTT solution(thiazolyl blue tetrazolium bromide)을 각 well에 40 μL씩 처리하여 1 시간 30 분 동안 incubator에 배양하였다. 그 후 각 well에 DMSO를 100 μL씩 처리하 여 formazan을 완전히 용해하였다. 이후 흡광도는 ELISAreader (Bio-Rad Labora-tories Inc., Hercules, CA, USA)에 서 595 nm로 측정하였다.

    세포 증식률 측정

    A375SM과 A375P를 60 dish에 2×105 cell/mL로 분주하 여 48 시간 동안 배양하였다. 그 후 소독된 1 mL blue tip 으로 스크래치를 하여 균일한 상처를 낸 뒤 상처 부위를 광학 현미경으로 관찰하였으며 ursolic acid를 0, 8, 12 μM 로 처치하여 24 시간 동안 배양하였다. 24 시간 후 ursolic acid를 처리하기 전에 관찰한 상처 부위를 광학 현미경으 로 관찰하였다.

    DAPI(4', 6-diamidino-2-phenylindole) 염색

    세포의 형태학적 변화는 DAPI(4', 6-diamidino-2-phenylindole) stain을 통하여 측정하였다. A375SM과 A375P를 60 dish에 2×105 cell/mL로 분주하여 24 시간 동안 배양하였다. 그 후 ursolic acid를 0, 8, 12 μM로 처리하여 24 시간 동안 배양 하였다. 24 시간 후 4% paraformaldehyde solution을 처리 하여 15 분 동안 고정시킨 뒤 DAPI solution을 처리하여 형광현미경(Zeiss fluorescence microscope, Carl Zeiss, Thornwood, NY, USA)으로 200배 시야에서 관찰하였다.

    Apoptosis 측정

    A375SM과 A375P를 흑색종 세포를 25-cm2 flask에 배 양하여 ursolic acid를 0, 8, 12 μM로 처리하여 24 시간 동 안 배양하였다. 배양 후 PBS로 세척한 뒤 trypsin-EDTA 를 이용하여 세포를 수거하였다. 수거한 세포는 1X binding buffer를 사용하여 1×106 cells/mL로 만들었다. Fluoresceinisothiocyanate(FITC)-conjugated annexin V와 phycoerythrin(PE)-conjugated propidium iodide을 첨가하여 15 분간 반응시킨 후 유세포 분석을 통해 측정하였다.

    웨스턴 블로팅

    흑색종 세포 A375SM과 A375P를 1×106 cells/mL로 배양 하여 ursolic acid가 첨가된 배양액을 처리한 후 24 시간 동 안 배양하였다. 그 후 trypsin EDTA를 사용하여 세포를 수 거한 후 원심분리(1,200 rpm, 5 min, 4ºC)하였다. 그리고 cell lysis buffer(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 첨가하여 4ºC에서 20 분간 반응시켰다. 20 분 후 13,000 rpm에서 5 분간 원심분리 하여 상층액을 취해 cell lysate로 사용하였 다. Cell lysate의 단백질 농도는 Bradford assay를 사용하여 측정하였다. Cell lysate를 12% SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)로 분리한 후 nitrocellulose membranes (Hercules, CA, USA)으로 이동시 켰다. Membrane은 5% skim milk-TBST (20 mM Tris·HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.1% Tween 20)에서 2 시간 동안 blocking한 후 anti-Bax(1:1000), anti-Bcl-2(1:1000), anti-β- actin(1:10000), anti-PARP(1:1000)으로 측정하고자 하는 antibody를 각각 첨가하여 4ºC에서 overnight하였다. 그 후 anti-rabbit IgG(1:1000)를 첨가하여 2 시간 동안 반응시켰다. 각 밴드는 imaging program인 Image J Launcher(provided by NCBI)를 이용하여 밀도를 측정하였다.

    통계 분석

    본 연구에서 얻은 모든 실험결과는 3회 반복하였으며, 그 결과는 평균 ± 표준편차를 사용하여 나타내었다. 각 군간의 유의성을 검증하기 위하여 one-way ANOVA에 이은 Dunnett’s t-test 분석을 시행하였다. 대조군과 비교하여 p<0.05일 때를 통계학적으로 유의하다고 판정하였다.

    Results

    흑색종 세포의 생존 능력에 대한 Ursolic acid의 영향

    흑색종 세포 A375SM, A375P에서 ursolic acid에 의한 세포 생존율을 확인하기 위하여 ursolic acid를 0, 4, 8, 12, 16, 20 μM의 농도로 24 h 처리 후 MTT assay를 진행하 였다. A375SM의 생존율은 100 ± 3.25%, 101.29 ± 2.50%, 66.81 ± 6.67%, 29.45 ± 11.22%, 20.6 ± 8.59%, 17.82 ± 11.80%로 ursolic acid 8 μM 부터 통계적으로 유의적인 감 소를 보였으며, A375P의 생존율 또한 100 ± 3.60%, 100.42 ± 2.94%, 68.85 ± 10.38%, 40.51 ± 13.68%, 35.78 ± 20.30%, 30.63 ± 15.16%로 ursolic acid 8 μM 부 터 통계적으로 유의적인 세포 생존율의 감소를 확인하였 다(Fig. 2).

    흑색종 세포의 증식에서의 Ursolic acid의 영향

    흑색종 세포에서의 증식률을 측정하기 위하여 ursolic acid를 0, 8, 12 μM로 24 h 처리 후 Wound healing assay 를 진행하였다. 측정은 스크래치 안에 24 시간 동안 늘어 난 세포수를 대조군과 비교하였고 대조군에서 늘어난 세 포수를 100%로 설정하였다. Ursolic acid를 흑색종 세포에 각각 0, 8, 12 μM로 처리한 결과, A375SM에서는 100 ± 8.81%, 77.34 ± 18.15%, 42.47 ± 10.06%, A375P에서는 100 ± 10.06%, 79.50 ± 13.21%, 61.93 ± 9.14%로 대조군 과 비교했을 때 통계적으로 유의적인 세포의 증식률 억제 를 관찰하였다(Fig. 3).

    Ursolic acid에 의한 흑색종 세포의 형태학적 변화

    흑색종 세포의 형태학적 변화를 확인하기 위하여 ursolic acid를 0, 8, 12 μM로 24 h 처리 후 DAPI 염색을 시행 하였다. DAPI 형광 염색에 반응한 apoptotic body를 counting하여 apoptosis가 유도된 세포를 정량화하여 분 석하였다. A375SM에서는 0.8 ± 0.83%, 18.0 ± 3.87%, 33.4 ± 4.44%, A375P에서는 3.4 ± 1.14%, 15.2 ± 2.58%, 33.0 ± 5.83%로 ursolic acid의 처치 농도에 따 라 통계적으로 유의적인 apoptotic body의 증가를 확인 하였다(Fig. 4).

    Ursolic acid에 의한 흑색종 세포의 apoptosis 유도

    흑색종 세포의 apoptosis 비율을 확인하기 위하여 ursolic acid를 각각 0, 8, 12 μM로 24 h 처치한 뒤 annexin V와 propidium iodide 염색 후 유세포 분석을 시행하였다. apoptosis 비율은 Annexin V 양성 세포의 비율로 측정하 였다. 분석 결과 A375SM에서는 13.13 ± 2.22%, 25.35 ± 2.85%, 35.53 ± 2.53%, A375P에서는 10.49 ± 3.83%, 22.47 ± 0.60%, 30.09 ± 2.09%로 ursolic acid의 처치 농 도에 따라 통계적으로 유의적인 apoptosis 비율의 증가를 확인하였다(Fig. 5).

    흑색종 세포에서의 Ursolic acid가 apoptosis 경로 단백 질 발현에 미치는 영향

    흑색종 세포의 단백질 발현 정도를 확인하기 위하여 ursolic acid를 각각 0, 8, 12 μM로 24 h 처리 후 western blot을 실시하였다. 그 결과 DNA를 수리하는 단백질로 알 려진 cleaved PARP와 apoptosis를 유도하는 단백질로 알 려진 Bax의 발현 정도가 12 μM 농도에서 증가한 반면, apoptosis를 억제하는 단백질로 알려진 Bcl-2의 발현 정도 는 12 μM 농도에서 감소한 것을 관찰하였다(Fig. 6).

    Discussion

    본 연구는 식물의 terpenoid 중 하나인 ursolic acid에 의 한 악성 흑색종 세포의 생존을 억제하고 세포자멸사 유도 를 알아보기 위해 전이성이 높은 악성 흑색종 세포인 A375SM과 전이성이 낮은 악성 흑색종 세포인 A375P를 대상으로 진행되었다. MTT assay를 통해 두 흑색종 세포 A375SM과 A375P의 세포 생존율을 측정해본 결과 두 세 포 모두 8 μM 농도에서부터 농도 의존적으로 유의적인 세 포 생존율의 감소를 확인하였다. Li 등23) 에 의하면 대장 암 세포주 HCT15에서 유의적인 세포감소를 확인하였다. 대다수의 암세포는 초기 암세포가 자라던 조직에서 증식 을 통해 주변 조직들로 전이된 후 체내 순환통로인 혈관 과 림프관을 통하여 이동, 또 다른 조직으로 증식과 전이 를 반복하며 새로운 종양을 만들어내는 특징이 있다. 이 러한 증식과 전이의 반복을 암세포의 전형적인 특성 중 일부분으로 생각한 본 연구에서는 앞서 MTT assay를 통 하여 A375SM과 A375P 흑색종 세포의 생존율에 유의적 인 영향을 미친 ursolic acid 농도를 흑색종 세포에 처치하 여 ursolic acid가 A357SM과 A375P 세포의 증식에 미치 는 영향을 확인하였다. Wound healing assay를 통하여 세 포 증식률을 확인한 결과 물질 처치군에서 Ray 등24) 과 같 이 증식률의 감소를 확인하였다. DAPI 염색에서는 형광현 미경으로 관찰한 결과 물질 처치한 군에서는 앞의 실험 결 과와 같이 세포의 증식이 억제되었으며, 억제물질 처치군 에서 Choi 등25) 과 같이 염색질 응축을 포함하는 세포자멸 사인 apoptosis의 특징 중 하나인 apoptotic body의 증가를 확인하였다. 유세포 분석에서는 Shan 등26) 과 같이 물질 처 치군에서의 apoptosis의 비율의 증가를 확인하였다. Western blot를 진행한 결과 12 μM 농도에서 Bcl-2의 감소는 Shan 등19) 의 연구에서 대장암세포주 HT-29에서 apoptosis 관련 단백질인 caspase-3과 caspase-9의 활성과 Bcl-2와 Bcl-xL감 소를 확인한 것과 같이 이전의 연구들과 유사한 기전으로 apoptosis의 유도를 확인하였으며 apoptosis 관련 단백질인 cleaved PARP, Bax의 증가 또한 확인하였다.

    Ursolic acid를 여러 암세포에 적용한 이전 연구들과 같 이 본 연구에서 ursolic acid의 흑색종 세포 A375SM과 A375P에 대한 항암 효능을 확인하였다. Ursolic acid는 항 암, 항산화 및 항염증제로서의 기능을 갖추고 있으나 Kashyap 등27)의 연구에서 부작용으로 염증 반응이 나타난 보고서 또한 일부 밝혀진 것으로 보여진다. 따라서 추후 항암 및 예방제로서의 효능을 평가하기 위한 in vivo 실험 에서는 ursolic acid의 투여량 설정에 주의가 필요할 것으 로 사료된다.

    국문요약

    우르솔릭산은 항암, 항산화, 항염증 작용과 같은 다양한 효과를 지니고 있다. 본 연구에서는 우르솔릭산이 인간 흑 색종 암세포인 A375SM과 A375P 세포에 항암효과가 있 는지 확인하였다. 두 세포의 생존율은 MTT assay를 통하 여 확인하였으며 증식률은 Wound healing assay로 확인하 였다. 두 세포의 apoptotic body와 apoptosis 비율의 확인 을 위한 DAPI 염색과 유세포 분석을 진행하였다. 그리고 웨스턴 블로팅을 통하여 흑색종 세포의 우르솔릭산의 농 도에 따른 apoptosis 단백질의 유도를 조사하였다. 우르솔 릭산의 처리 농도에 따라 흑색종 세포의 생존율 감소와 증식률 감소를 확인하였다. DAPI 염색을 통하여 우르솔 릭산의 농도가 증가함에 따라 흑색종 세포의 염색체 응축 이 농도 의존적으로 증가하였고, 유세포 분석을 통하여 우 르솔릭산에 대하여 농도 의존적으로 흑색종 세포의 apoptosis 비율의 증가를 확인하였다. 그리고 웨스턴 블로팅을 통해 흑색종 세포 A375SM과 A375P의 우르솔릭산 12 μM 농 도에서 cleaved-PARP와 Bax의 증가와 Bcl-2의 감소를 확 인하였다. 본 연구는 우르솔릭산의 농도를 0 에서 20 μM 수준의 저농도에서 진행하였으며, 물질 처리 후 24 시간 뒤 결과를 가지고 분석하였다. 본 연구의 결과로 보아 우 르솔릭산은 흑색종 세포 A375SM과 A375P에서 apoptosis 관련 단백질들의 조절을 통해 항암효과를 일으키는 것으 로 사료된다.

    Acknowledgement

    이 논문은 2017년도 정부(교육과학기술부)의 재원으로 한국연구재단의 지원을 받아 수행된 기초연구사업임(NRF- 2017R1A2B4005516)

    Figure

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    Chemical structure of Ursolic acid.

    JFHS-34-2-183_F2.gif

    Effect of ursolic acid on the cell viability in A375SM (A), A375P (B) cells. Each cell was treated with absence or presence of ursolic acid (0, 4, 8, 12, 16, 20 μM) for 24 h by MTT assay. Data are shown as mean ± SD of three independent experiments performed in triplicate. Significance was determined by Dunnett’s t-test with *p<0.05 considered as statistically significant compared with non-treated controls.

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    Effect of ursolic acid on the cell proliferation of melanoma cells. A375SM (A) and A375P (B) melanoma cells were treated with ursolic acid 0, 8 and 12 μM for 24 h, and cell proliferation was then measured by wound healing assay. Cell proliferation of the wound for any field of view was measured at 3 different locations (C, D). Data represent the means ± SD of at least three replicates relative to the control. Significance was determined by Dunnett’s t-test with *p<0.05 considered as statistically significant compared with nontreated controls.

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    Effect of ursolic acid-induced apoptosis on A375SM, A375P cells. A375SM (A), A357P (B) cells were treated with absence or presence of ursolic acid (8 and 12 μM) for 24 h and apoptotic bodies were stained with DAPI. Chromatin condensation, representing apoptotic cell death, was examined using a fluorescence microscope (×200). Indicated bar is 10 μm. The graphs show quantification of DNA fragmentation and nuclear condensation in A375SM (C), A357P (D) cell. Each bar represents the mean ± SD calculated from three independent experiments in triplicate. Significance was determined by Dunnett’s t-test with *p<0.05 considered as statistically significant compared with non-treated controls.

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    Effect of ursolic acid-induced apoptosis rates on A375SM, A375P cells. A375SM (A), A375P (B) cell were treated with absence or presence of ursolic acid (8 and 12 μM) for 24 h and apoptosis and necrosis cell were stained with annexin V and propidium iodide. Apoptosis and necrosis were analyzed by flow cytometery analysis. The graphs show quantification of apoptosis rates (annexin V-positive cells) in A375SM (C), A357P (D) cell. Significance was determined by Dunnett’s t-test with *p<0.05 considered as statistically significant compared with non-treated controls.

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    Ursolic acid down-regulated the expression of Bcl-2 and activated cleaved PARP and Bax. A375SM (A), A375P (B) Cells were treated with 0, 8 and 12 μM ursolic acid for 24 h, the expression levels of Bcl-2 and the activation of cleaved PARP and Bax was detected by Western blot analysis.

    Table

    Reference

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