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ISSN : 1229-1153(Print)
ISSN : 2465-9223(Online)
Journal of Food Hygiene and Safety Vol.34 No.3 pp.309-315
DOI : https://doi.org/10.13103/JFHS.2019.34.3.309

Efficiency of PetrifilmTM Staph Express Count Plate for the Enumeration of Staphylococcus aureus in Meat, Fishery Product, and Korean Traditional Foods

Yoonjeong Yoo, Yuna Choi, Seungho Choi1, Hyunjo Bang1, Yohan Yoon2, Jimyeong Ha2*, Soomin Lee2*
Department of Food and Nutrition, Sookmyung Women’s University, Seoul, Korea
1Food Safety Division, 3M Korea, Seoul, Korea
2Risk Analysis Research Center, Sookmyung Women’s University, Seoul, Korea

Yoonjeong Yoo and Yuna Choi are equally contributed.



Co-correspondences to: Soomin Lee, Risk Analysis Research Center, Sookmyung Women’s University, Seoul 04310, Korea Tel: +82-2-2077-7585, Fax: +82-2-710-9479 E-mail: slee0719@naver.com

Co-correspondences to: Jimyeong Ha, Risk Analysis Research Center, Sookmyung Women’s University, Seoul 04310, Korea Tel: +82-2-2077-7585, Fax: +82-2-710-9479 E-mail: hayan29@naver.com
April 11, 2019 April 30, 2019 May 24, 2019

Abstract


To enumerate Staphylococcus aureus in food, Baird-Parker Agar (BPA) is usually used in the conventional method, However it requires time and space for the preparation and plating, and incubation. Thus, use of the 3MTM PetrifilmTM Staph Express Count Plate (STX Petrifilm) might be appropriate to solve these challenging problems. The purpose of this study was to compare the efficiency of STX Petrifilm with BPA for enumeration of S. aureus in various foods. A mixture of S. aureus strains ATCC29213, ATCC25923, and ATCC13565 was inoculated on marinated pork chop, beef (chuck tender), dried filefish, semi-dried squid, rice cake, and Japchae (stir-fried glass noodles) at 2, 3, 5, and 7 Log CFU/g. S. aureus cell counts were enumerated by spread-plating on STX Petrifilm and BPA after 0 and 24 hours at 4°C (marinated pork chop, beef, semi-dried squid, and stir-fried glass noodles) and 25°C (dried filefish and rice cake). Recovery of STX Petrifilm for S. aureus from various food samples was compared with BPA, and the results showed that there were no significant differences between two selective media in all cases. The results indicated that STX Petrifilm had enough efficiency to recover S. aureus from various foods as well as saving time and space.



축·수산·전통식품 중 황색포도상 구균의 정량적 분석을 위한 PetrifilmTM Staph Express Count Plate의 성능 평가

유윤정, 최유나, 최승호1, 방현조1, 윤요한2, 하지명2*, 이수민2*
숙명여자대학교 식품영양학과
1한국쓰리엠 식품안전사업팀
2숙명여자대학교 위해분석연구센터

초록


    최근 생활수준 향상과 1인 가정 증가에 따른 식생활 패 턴 변화로 도시락, 김밥, 샌드위치 등 즉석섭취 식품을 섭 취하는 비율이 대폭적으로 늘고 있다. Kim 등1)의 연구에 따르면 5 종류(김밥, 초밥, 회, 샐러드, 샌드위치)의 즉석 섭취 식품에서 Staphylococcus aureus가 모두 검출되었으 며, 식중독 세균 중 가장 높은 검출률을 보였다. 더불어, S. aureus에 오염된 식품을 섭취하여 식중독에 걸리거나 식품에서 S. aureus가 검출되어 제품이 회수 조치된 사례 가 꾸준히 발생하고 있다. 추가적인 조리, 가열 없이 섭취 하는 즉석섭취 식품의 경우, 식중독 세균 노출 시 대규모 식중독 사고를 발생시킬 가능성이 있으므로 오염에 주의 해야 한다2).

    식품에서 S. aureus를 신속, 정확하게 검출하는 것은 식 품의 안전성을 평가하는 데 중요하다. S. aureus를 비롯하 여 다양한 식중독 세균을 식품으로부터 분리하기 위하여 주로 선택배지를 사용하는데, 해당 검출법은 정확한 방법 이나 많은 시간이 소요된다3). S. aureus 검출을 위한 선택 배지로 난황첨가 만니톨 식염한천배지(mannitol salt egg yolk agar, MSEY agar), Baird-Parker 한천배지(baird-parker agar, BPA), 토끼 혈장(RPF)이 첨가된 Baird-Parker 한천배 지, Vogel johnson agar, CHROMagar staph aureus, RAPID’ Staph 등이 있다.

    전 세계적으로 S. aureus의 분석을 위하여 주로 BPA나 만니톨 식염한천배지(mannitol salt agar; MSA)를 허용하 고 있으나, Wilson 등4)의 연구결과에 따르면 BPA를 이용 하여 여러 식품에서 S. aureus를 분리할 때, 투명한 환이 형성되지 않아 추가적인 확인시험이 필요할 수 있다고 한 다. 또한 MSEY agar의 경우, 국내 식품공전5)에 따르면 S. aureus 정성 시험 시에만 인정되는 배지이며, 정량 시험 시에는 인정되지 않는다. Kim 등6)의 연구결과에 따르면 Listeria도 MSA에서 S. aureus의 전형적인 집락을 나타내 검출에 혼돈이 있다고 한다. 더불어 두 한천배지는 121ºC 에서 15분간 멸균 후 egg yolk enrichment를 첨가하여 굳 힌 후 사용해야 하기 때문에 사용 전 제조 시간이 오래 소요되며 인큐베이터 배양 시 많은 공간이 확보되어야 한 다는 단점이 있다.

    현대 산업 현장에서는 신속하고 정확한 균체 검출을 요 구하고 있어, 표준화된 공정에 의해 완제품으로 제공되는 건조필름법 사용이 보편화 되어 있다. 건조필름은 전통적 인 한천배지에 비하여 표준화된 공정을 통해 완제품 상태 로 만들어져 실험자가 실험 전 배지를 준비하는 데 소요 되는 시간을 단축해주고, 한천배지보다 부피가 작아 배양 시 차지하는 공간을 줄일 수 있다. 또한 실험 시 분주 후 도말 과정 없이 바로 배양하기 때문에 실험 소요시간을 줄여 일의 능률을 높인다. 특히 S. aureus 검출용 건조필 름인 PetrifilmTM Staph Express Count Plate (STX Petrifilm)는 배양 후 S. aureus 균체만 선택적으로 염색하 기 때문에 실험자가 쉽게 구분해 낼 수 있다는 장점이 있 다. 하지만 STX Petrifilm의 S. aureus 검출 효율 평가가 이루어진 바 없어 다른 배지들과 검출 효율을 비교해볼 필요가 있다.

    따라서 본 연구에서는 축산식품, 수산식품, 전통식품을 대상으로 BPA와 STX Petrifilm을 이용하여 S. aureus 정 량시험을 실시하고, 그 결과를 비교·분석함으로써 S. aureus 검출용 건조필름의 성능을 평가하였다.

    재료 및 방법

    재료

    본 연구에 사용된 식품 시료는 축산식품, 수산식품, 전 통식품으로 구분하였다. 축산식품에는 돼지고기 주물럭 (marinated pork chop)과 육회용 꾸릿살(beef; chuck tender), 수산식품에서는 쥐포(dried filefish)와 반건조 오징어(semidried squid)를 사용하였고, 전통식품에는 떡(rice cake)과 잡채(Japchae; stir-fried glass noodles)를 2018년 12월에 2 개씩 총 3회 구입하여 실험을 진행하였다. 쥐포, 반건조 오징어와 당일 생산된 돼지고기 주물럭, 잡채는 서울 시 내 대형마트에서 구입하였으며, 서울역 인근 정육점에서 육 회용 꾸릿살, 떡집에서 당일 생산된 호박떡을 구입하였다. 시험법에는 BPA (MBcell, CA, USA)를 구입하여 사용하였 으며, 건조필름은 STX Petrifilim (3M, St. Paul, MN, USA) 을 사용하였고, 적자색 균체 확인을 위해 확정용 디스크 3MTM PetrifilmTM Staph Express Disk (3M)를 사용하였다.

    사용 균주

    본 연구에서는 S. aureus (ATCC29213, ATCC25923, ATCC13565)를 American Type Culture Collection (ATCC) 에서 분양 받아 사용했으며, 각 균주는 20% glycerol을 함 유하여 -70ºC에 보관하며 사용하였다.

    회수율 분석

    식품 시료에 대해 식품공전5)에 수록된 S. aureus 정성시 험법에 준하여 MSEY agar와 BPA를 이용하여 S. aureus 검출 시험을 예비실험으로써 실시하였다. MSEY agar보다 BPA의 민감도가 높은 것으로 판단되어 식품공전에 등재 되어 있는 BPA와 STX Petrifilm의 각 식품 시료에 대한 S. aureus 회수율을 분석하였다. S. aureus 단일 집락을 tryptone soy broth (TSB, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA) 10 mL에 현탁하여 37ºC의 조건에서 24 시간 배양한 후, 균액 0.1 mL을 새로운 TSB 10 mL에 현 탁하고 동일한 조건에서 배양시켜 세균의 활성을 최대화 시켰다. S. aureus 혼합 균액을 1,912 ×g, 4ºC에서 15분 동 안 원심분리한 후 phosphate-buffered saline (PBS) 용액으 로 총 2회 세척하여 접종할 균액을 준비하였다. 6종의 식 품 시료(돼지고기 주물럭, 육회용 꾸릿살, 쥐포, 반건조 오 징어, 떡, 잡채)를 무균적으로 멸균백에 25 g씩 담은 후 각각의 시료에 세균이 2, 3, 5, 7 Log CFU/g가 되도록 십 진 희석하여 S. aureus 균액 0.1 mL을 접종한 후, 30 번 씩 문질러 균액을 시료에 균질화 시켰다. 15분의 부착시 간을 가진 후 0시간에 해당하는 회수율을 분석하였다. 회 수율 분석을 위해 50 mL의 0.1% buffered peptone water (BPW, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA) 희석 용액을 시료에 첨가하여 균질기(BagMixer, Interscience, St. Nom, France)에서 60초간 균질화한 후, 균질액을 0.1% BPW 용액에 단계별로 희석하여 BPA와 STX Petrifilm에 평판 도말하였다. 또한 접종 24시간 후에 회수율을 분석 하기 위해 1일간 각 시료의 보관 온도인 4ºC(돼지고기 주 물럭, 육회용 꾸릿살, 반건조 오징어, 잡채)와 25ºC(쥐포, 떡)에 저장한 다음 0시간과 동일한 시험법을 실시하였다. 24시간 배양 후에 BPA에서는 투명한 띠로 둘러싸인 광택 이 있는 검정색 집락을 계수하였고, STX Petrifilm은 제조 사인 3M 주식회사의 실험방법에 따라 적자색으로 염색되 어 나타나는 집락을 계수하였다. 그러나 적자색 이외의 검 정색이나 녹색 계열의 집락이 나타나거나 불순물로 인하 여 적자색 집락의 확인이 어려운 경우는 2차 확정용 디스 크를 삽입하여 동일한 온도에서 3시간의 추가 배양을 하 여 분홍색의 구역이 관찰되는 집락을 계수하였다.

    통계 분석

    각 시료에 대한 회수율 분석 시험은 샘플을 2개로 하여 총 3회 반복 실험(n=6)을 통해 얻은 CFU/g을 Log10값으로 전환하여 통계 처리하였다. BPA와 STX Petrifilm을 사용 하여 얻은 결과를 통계 프로그램 SAS (Version 9.4, SAS Institute, Cary, NC, USA)의 paired t-test를 이용하여 α=0.05 수준에서 비교·분석하였다.

    결과 및 고찰

    회수율 분석

    6 종류의 시료에 대하여 예비실험으로써 증균배양 후 MSEY agar와 BPA에 획선도말을 한 결과, BPA가 MSEY agar보다 더 많은 시료에서 양성으로 확인되었기 때문에 민감도가 더 높다고 판단하였다. Oh 등7)의 연구에서 S. aureus에 대한 MSA, BPA, STX Petrifilm의 민감도를 비교 한 결과 각각 76.6%, 86.6%, 90%로 나타났고, Kim 등3) 또 한 MSA에서 ListeriaS. aureus의 전형적인 집락 형태 를 나타내었다고 보고함에 따라 S. aureus 선택배지 중 MSA의 민감도가 비교적 낮음을 확인할 수 있었다. 따라 서, 본 실험에서는 STX Petrifilm과 식품공전에 등재된 선 택배지 중 민감도가 높은 BPA의 회수율을 비교하였다.

    회수율 측정을 위해 6가지 시료에 S. aureus를 농도 별 로 접종하여 배양한 결과, 2, 3, 5, 7 Log CFU/g이 되도 록 접종한 모든 시료에서 0시간과 24시간 후에 STX Petrifilm과 BPA에서 S. aureus가 비슷한 수준으로 회수된 것을 확인할 수 있었으며(Fig. 1, 2, 3, 4), 이를 통계 처리 한 결과 BPA와 STX Petrifilm으로 얻은 세균 수의 유의 적인 차이는 없었다(P>0.05). Kim 등8)은 한국 전통식품에, Viçosa 등9)은 원유와 치즈에 S. aureus를 접종한 후 회수 율을 조사하였고 그 결과 기존의 전통적인 미생물 시험법 과 STX Petrifilm을 사용한 시험법에 유의적 차이가 없는 것으로 보고하여 본 연구 결과와 일치함을 확인할 수 있 었다. 같은 접종농도에서 시료별로 회수된 S. aureus 세균 수의 차이는 시료별로 존재하는 일반세균수의 차이 때문 인 것으로 판단된다. Lee 등10)의 연구 결과에서 식품 내 일반 세균수가 많을 경우, 저농도의 식중독 세균은 식품 에서 생장이 저해되는 것을 확인하였다. 따라서 본 연구 에서도 식품 시료에 존재하는 일반 세균수가 S. aureus 회 수율에 영향을 주어 시료 별 결과 차이가 나타났을 것이 라고 판단된다.

    Souza 등11)은 중온성 호기성 세균에서 기존의 전통적인 미생물 시험법과 petrifilm을 이용한 시험법의 상관계수가 높다고 보고하였으며, STX Petrifilm 사용법은 기존의 전 통적인 미생물 시험법과 비교하여 회복능이 우수했다고 보고하였다. Ingham 등12)은 몇몇 식품에서 분리된 S. aureus 는 BPA에서 전형적인 집락 형상을 띄지 않는 경우가 있 다고 보고하였다.

    결론적으로 STX Petrifilm은 식품내에 존재하는 S. aureus 를 정량적으로 분석하는데 있어 기존의 선택배지와 큰 차 이가 없으므로, 기존 배지의 사용을 대체할 수 있을 것으 로 생각되며 이로 인해 분석 시간의 단축과 최소 배양공 간의 활용이 가능할 것으로 판단된다.

    요 약

    본 연구는 식품으로부터 S. aureus를 분리하는 데 사용 되는 선택배지들의 성능을 평가하였다. 먼저 BPA와 MSEY agar의 민감도 비교를 통해 BPA를 선택하였고, 이 배지의 회수율을 3MTM PetrifilmTM Staph Express Count Plate (STX petrifilm)의 회수율과 비교하였다. 축산식품 중 돼지 고기 주물럭과 육회용 꾸릿살, 수산식품 중 쥐포와 반건 조 오징어, 전통식품 중 떡과 잡채를 선정하여 S. aureus 를 접종한 후 BPA와 STX Petrifilm 배지를 사용하여 회 수율 분석 실험을 실시하였다. 6가지 식품에 대해 인위적 으로 S. aureus를 저농도에서부터 고농도까지 접종한 후 0 시간과 24시간 후의 검출률을 측정하였다. 두 배지 간의 유의 수준을 분석한 결과 식품의 종류, 접종 농도에 관계 없이 두 선택배지 간에 통계적 유의차는 없는 것으로 확 인되었다(P>0.05). 따라서 STX Petrifilm은 BPA를 대체할 수 있을 뿐만 아니라 배지의 준비 및 도말에 소요되는 분 석시간을 절감하고 배양에도 최소한의 공간이 필요하게 되어 신속, 정확한 분석에 크게 기여할 수 있을 것으로 판 단된다.

    Figure

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    Comparison of Petrifilm™ Staph Express Count plate and Baird-Parker agar for Staphylococcus aureus enumeration in foods at 2- Log inoculation level. (A) marinated pork chop, (B) beef (chuck tender), (C) dried filefish, (D) semi-dried squid, (E) rice cake, and (F) Japchae. There were no significant differences in all samples (P>0.05).

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    Comparison of Petrifilm™ Staph Express Count plate and Baird-Parker agar for Staphylococcus aureus enumeration in foods at 3- Log inoculation level. (A) marinated pork chop, (B) beef (chuck tender), (C) dried filefish, (D) semi-dried squid, (E) rice cake, and (F) Japchae. There were no significant differences in all samples (P>0.05).

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    Comparison of Petrifilm™ Staph Express Count plate and Baird-Parker agar for Staphylococcus aureus enumeration in foods at 5- Log inoculation level. (A) marinated pork chop, (B) beef (chuck tender), (C) dried filefish, (D) semi-dried squid, (E)rice cake, and (F) Japchae. There were no significant differences in all samples (P>0.05).

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    Comparison of Petrifilm™ Staph Express Count plate and Baird-Parker agar for Staphylococcus aureus enumeration in foods at 7- Log inoculation level. (A) marinated pork chop, (B) beef (chuck tender), (C) dried filefish, (D) semi-dried squid, (E) rice cake, and (F) Japchae. There were no significant differences in all samples (P>0.05).

    Table

    Reference

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