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ISSN : 1229-1153(Print)
ISSN : 2465-9223(Online)
Journal of Food Hygiene and Safety Vol.34 No.3 pp.277-282
DOI : https://doi.org/10.13103/JFHS.2019.34.3.277

Comparison of Loop-mediated Isothermal Amplification and Korea Standard Food Codex (KFSC) Method for Detection of Salmonella Typhimurium, Listeria monocytogenes Artificially Inoculated in Yuk-hwe and Yuk-Sashimi

Seung-Hae Gwak, So-Young Lee, Jin-Hee Kim, Se-Wook Oh*
Department of Food and Nutrition, Kookmin University, Seoul, Korea
Correspondence to: Se-Wook Oh, Department of Food and Nutrition, Kookmin University, Seoul, 02707, Korea Tel.: +82 2 910 5778; Fax: +82 2 910 5249. E-mail address: swoh@kookmin.ac.kr
March 28, 2019 May 13, 2019 June 10, 2019

Abstract


The object of this study is to compare the performance of the 3M Molecular Detection Assay 2 (3M MDA 2) and the Korea Standard Food Codex (KSFC) Method (i.e., isolation media and real-time PCR) in detecting Salmonella Typhimurium and Listeria monocytogenes in traditional Korean foods. Yuk-hwe and Yuk-Sashimi (types of raw beef dishes) were artificially inoculated with 100–104 CFU/25 g of L. monocytogenes and S. Typhimurium. Citrobacter freundii and Listeria innocua were used as competitive microflora. After enrichment, the samples were analyzed using 3M MDA 2 and real-time PCR. All samples inoculated at concentrations of 100–104 CFU/25 g without competitive microflora were positive for S. Typhimurium and L. monocytogenes, as detected by 3M MDA 2 and Korea Standard Food Codex (KFSC) Method. In addition, part of the samples were positive for the presence of C. freundii and L. innocua. The 3M MDA 2 – Salmonella and Korea Standard Food Codex (KFSC) Method showed similar detection performances in Yuk-hwe and Yuk-Sashimi. The 3M MDA 2 method for Salmonella and Listeria, which is a LAMP-based technology, can be used for rapid detection of S. Typhimurium and L. monocytogenes in raw beef. LAMP bioluminescence assays provide results on the subsequent day and are simple to use compared with the Korea Standard Food Codex (KFSC) Method, particularly in terms of DNA preparation.



육회와 육사시미에 접종된 Salmonella TyphimuriumListeria monocytogenes 검출을 위한 Loop-mediated isothermal amplification와 식품공전의 배지 시험법, real-time PCR의 검출 성능 비교

곽승해, 이소영, 김진희, 오세욱*
국민대학교 식품영양학과

초록


    Salmonella spp.는 그람 음성, 통성혐기성 균이며 세균성 식중독의 원인인 대표적인 병원균으로 주로 사람이나 동물 의 장에서 서식하여 분변을 통해 식품에 오염된다. Salmonellosis는 Salmonella에 의해 전세계적으로 가장 빈번 하게 발생하는 질환이며 Salmonella를 가진 사람이나 동물, 우유, 달걀 등에 의해 다른 식품으로 오염될 수 있다1). 대 표적으로 S. Typhimurium과 S. Enteritidis가 가장 심각한 식 중독을 발생시키며 감염, 발병 대상에 대한 특이성이 없어 사람과 동물 모두에게 치명적인 것으로 알려져 있다2).

    Listeria monocytogenes는 그람 양성, 통성혐기성 균이며 Salmonella와 마찬가지로 세균성 식중독을 일으키는 대표적 인 원인균으로 listeriosis를 일으키는 병원성 미생물이다. L. monocytogenes는 조리되지 않은 육류나 육류가공식품, 즉석 식품에 많이 오염되며 저온에서도 생장할 수 있는 것으로 알려져 있다3).

    육회는 소고기를 채썰어서 익히지 않고 양념에 무쳐 먹 는 음식이고 육사시미는 소고기를 얇게 저며 익혀 먹지 않는 음식이다. 육회와 육사시미는 가열처리를 하지 않고 바로 섭취하는 음식이기 때문에 S. TyphimuriumL. monocytogenes에 의한 식중독의 위험성이 크다.

    현재 우리나라 식품공전에는 Salmonella와 Listeria 검출 방법으로 배지를 이용한 방법이 있다4). SalmonellaListeria 검출 방법에는 증균배양, 분리배양, 확인시험으로 진행되기 때문에 확정까지 약 일주일의 시간이 소요된다5). 배지를 이용한 방법은 많은 시간이 걸리기 때문에 식중독균을 신 속하게 검출할 수 없으며 많은 노동력을 필요로 하여 효 율성이 떨어진다고 알려져 있다6). 따라서 예방차원의 효 율적인 식품안전 관리를 위해서는 식중독균을 신속하고 정확하게 검출할 수 있는 기술이 필요하다.

    신속검출법에는 주형 DNA를 이용한 polymerase chain reaction (PCR)이 널리 이용되고 있으며, 우리나라 식품공 전에도 real-time PCR을 통한 분자생물학적 시험방법이 등 재되어 있다7). Real-time PCR법은 기존 conventional PCR 과는 달리 전기영동 과정이 필요하지 않아 DNA 증폭 결 과를 실시간으로 컴퓨터에서 확인이 가능하다8). 또한 최 근에는 looped-mediated isothermal amplification (LAMP) 를 이용한 검출방법이 활발히 개발되고 있는데, LAMP는 등온에서 DNA 증폭이 가능하므로 PCR 방법보다 소요되 는 시간이 짧고 PCR 방법에 비해 배지, 생물로부터 유래 된 물질, 식품 성분 등과 같은 저해물질에 대한 영향을 받 지 않는다고 보고되어 있다9).

    본 연구에서는 육회와 육사시미에서 S. TyphimuriumL. monocytogenes의 검출에 대하여 식품공전에 등재된 분 리배지와 real-time PCR 그리고 LAMP를 이용하여 검출 성능을 비교하고자 하였다.

    Materials and Methods

    사용 균주 및 활성화

    S. Typhimurium (ATCC 19585), L. monocytogenes (ATCC 7644), Citrobacter freundii (KCTC 2359), L. innocua (KCTC 3586)는 한국미생물자원센터(Korean Collection for Type Cultures, KCTC, Jeollabukdo, Korea) 에서 분양 받아 -80ºC에서 glycerol stock (v/v)에 보관하 여 사용하였다. 모든 균주는 tryptic soy broth (Difco, Franklin Lakes, NJ, USA) 10 mL에 0.1 mL 접종하여 37ºC 에서 9시간 동안 1차 배양하고 18시간 동안 2차 배양하 여 균주를 활성화시킨 후 실험에 사용하였다.

    시료 준비 및 미생물 접종

    2019년 1월 2회에 걸쳐 육회는 서울시 종로구에 위치한 음식점에서 구매하였고 소고기를 채썰어 양념에 무쳐진 상태에서 실험에 사용하였으며 육사시미는 원료 부위를 성북구 대형마트에서 사서 직접 얇게 저민 후에 사용하였 다. 시료에 균을 접종하기 위하여 25 g씩 멸균 비닐백 (Whirl-pak, 1930 cm; Nasco, Fort Atkinson, WI, USA)에 넣고 100–104 CFU/mL수준으로 배양한 S. TyphimuriumL. monocytogenes 균 배양액을 각각 1 mL씩 접종하였다. S. Typhimurium을 접종한 시료에는 225 mL의 buffered peptone water (BPW; Oxoid, Basingstoke, Hampshire, UK)를 넣고 L. monocytogenes을 접종한 시료에는 각각 225 mL의 Listeria enrichment broth (LEB; Oxoid, Basingstoke, Hampshire, UK)와 3M Demi-Fraser broth (3M DFB; 3M Food Safety, St. Paul, MN)를 넣어 30초간 stomaching을 하였다. 결과적으로 S. TyphimuriumL. monocytogenes가 각각 100–104 CFU/25 g 수준이 되도록 접종하였다. 그리고 LAMP (3M MDS 2)방법과 식품공전 상의 분리배지와 real–time PCR을 이용하여 분석하였다.

    식품공전 배지 시험법을 이용한 검출

    S. TyphimuriumL. monocytogenes을 검출하기 위하여 각각 225 mL의 BPW와 LEB를 넣고 37ºC에서 24시간동 안 증균배양 시킨 후, 각각의 선택배지인 xylose-lysinedeoxycholate agar (XLD; Oxoid, Hampshire, UK)와 Listeria selective agar base (Oxford formulation, Oxoid, Hampshire, UK)에 도말하여 확인하였다. 도말 후 37ºC에서 24시간 배 양하고 XLD, Oxford 배지에서 검은색 집락을 분리하여 생 화학적 확인시험을 통해 양성유무를 확인하였다.

    식품공전 분자생물학적 시험법을 이용한 검출

    S. Typhimurium, L. monocytogenes가 접종된 시료들은 각각 225 mL의 BPW와 LEB를 넣어 37ºC에서 24시간동 안 증균배양을 진행하였다. Stomaching한 후에 균질액 1 mL을 PrepMan Ultra Sample Preparation Reagent (Applied Biosystems, Foster city, CA, USA)를 이용하여 DNA를 추출하였고, 최종 elution volume을 100 μL로 하 였다. 추출한 DNA는 PCR primer와 반응 온도에 따라 realtime PCR 분석을 진행하였다. Real-time PCR을 위한 반 응물의 조성은 SensiFAST Probe Hi-ROX mix (Bioline, London, UK) 13 μL, 400 nM 정방향 및 역방향 primer, 100 nM probe와 DNA 주형 2 μL로 구성하여 총 20 μL가 되도록 하였다. Real-time PCR은 StepOne Plus real-time PCR systems (Applied Biosystems, Foster, CA, USA)을 이 용하여 수행하였다.

    Loop-mediated isothermal amplification을 이용한 검출

    Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) 검출 방 법으로 3M Molecular Detection Assay 2 (3M MDA 2; 3M Food Safety, St. Paul, MN, USA)를 사용하였다. S. TyphimuriumL. monocytogenes을 접종한 시료에 각각 225 mL의 BPW와 3M DFB를 넣고 37ºC에서 24시간동안 증균배양하였다. 제조사의 지침에 따라 접종된 식품 균질 액 20 μL를 3M Molecular Detection Assay kits (3M Food Safety, St. Paul, MN, USA)의 lysis tube에 넣고 100ºC에 서 15분 동안 열처리 하였다. 열처리 이후, lysis tube를 냉 각용 블록에서 5분간 냉각시켰다. Lysis tube의 상층액 20 μL를 취하여 각각의 S. Typhimurium, L. monocytogenes 를 타겟으로 하는 reagent tube에 분주하고 pipetting으로 혼합하였다. 또 식품 균질액을 넣지 않은 lysis 용액 20 μL 를 reagent control과 negative control tube에 분주해 양성 , 음성 대조구로 설정하였다. 모든 샘플은 3M Molecular Detection Speed Loader Tray (3M Food Safety)에 넣고 3M Molecular Detection instrument (3M Food Safety)에 넣어 75분간 반응하였다. 증폭과 검출 결과는 실시간으로 컴퓨터를 통해 확인하였다.

    경쟁적 생장균주 유무에 따른 3M MDA 2 검출

    각각 시료 25 g에 S. Typhimurium을 100 CFU/25 g수준으 로 접종하고 S. Typhimurium와 유사한 O 항원을 가진 C. freundii를 102 CFU/25 g수준으로 접종하였다. 같은 방법으로 시료 25 g에 L. monocytogenes을 100 CFU/25 g수준으로 접 종하고 L. innocua를 102 CFU/25 g수준으로 접종하였다. 또 한 시료 25 g에 S. TyphimuriumL. monocytogenes만을 100 CFU/25 g으로 접종한 처리구를 대조구로 설정하였으며 분 리배지, real-time PCR 및 3M MDA 2를 이용하여 검출하 였다. 각각의 처리구들을 10번씩 반복하여 실험하였으며 양성으로 검출된 결과만을 표로 나타내었다.

    Results and Discussion

    식품공전시험법과 LAMP를 이용한 검출 성능 비교

    S. Typhimurium을 육회와 육사사미에 농도별로 접종한 후 3M MDA 2 – Salmonella를 이용하여 검출하였으며 성 능비교를 위하여 우리나라 식품공전방법 중 분리배지와 real-time PCR로 동시에 분석하였다(Table 1). 그 결과 육 회에서는 100–104 CFU/25 g를 접종한 모든 시료에서 S. Typhimurium가 양성으로 검출되었다. 육사시미에서 101CFU/25 g 이상의 농도로 접종한 시료에서는 모두 S. Typhimurium가 양성으로 검출되었지만 100 CFU/25 g으로 접종한 시료에서는 부분적으로 음성인 시료가 있었다. Realtime PCR로 실험한 경우 3개의 시료 중 2개에서 검출되 었는데, 3M MDA 2를 사용하였을 때도 동일한 결과로 나 타났다. 따라서 3가지 검출 방법에 따라 검출 성능 차이 는 없는 것으로 판단되었다.

    L. monocytogenes을 육회와 육사사미에 100–104 CFU/25 g 의 농도별로 접종하여 3M MDA 2 – Listeria와 식품공전 의 분리배지와 real-time PCR로 검출 실험을 실시하였다 (Table 2). 그 결과 육회와 육사시미 모두 101 CFU/25 g 이 상의 농도로 접종했을 때, 모두 L. monocytogenes가 양성 으로 검출되었지만 100 CFU/25 g으로 접종한 시료에서는 부분적으로 음성 결과가 나타났다. 분리배지나 real-time PCR로 분석하였을 때, 육회에서는 3개의 시료 중 1개에 서 검출되었고 육사시미에서는 real–time PCR을 이용한 결 과에서만 3개 중 1개에서 검출되었다. 육회에서는 분리배 지에서 3M MDA 2 결과보다 3개 중 1개로 검출되었지만 육사시미에서는 3개 시료 모두 분리배지에서 검출되었다. 육회에서 100 CFU/25 g으로 접종한 경우 L. monocytogenes 가 매우 낮은 수준으로 존재했기 때문에 검출 결과에 차이 가 난 것으로 판단되었다. 100 CFU/25 g으로 접종했을 때, 육 회와 육사시미 모두 real-time PCR 보다 LAMP에서 더 민 감한 수준으로 검출되었는데, 이는 LAMP가 PCR에 비해 배 지, 식품 성분 등에 대하여 DNA 증폭 저해 영향을 덜 받 았기 때문으로 생각되었다9). 3M MDA 2와 식품공전 방법 의 검출 한계는 100 CFU/25 g 으로 확인하였다. 반복처리구 의 수가 적어 통계적 분석은 하지 않았지만, 이는 real-time PCR보다 3M MDA 2가 더 민감한 수준으로 검출하였다 고 할 수 있었다. Cho AR 등10)의 연구에서도 12시간 증 균액에 대하여 LAMP와 PCR의 검출한계를 비교했을 때, LAMP는 3.2×100 CFU/mL이었으나 PCR에서 검출한계가 10배 떨어졌는데, 이는 LAMP에서 지방, 단백질 등에 대 한 반응 저해가 일어나지 않아 PCR에 비해 더 민감하게 검출되었기 때문이라고 하였다.

    경쟁적 생장균주 유무에 따른 3M MDA 2 검출 성능 비교

    분리배지와 real-time PCR, LAMP의 검출 한계는 100CFU/25 g으로 확인하였으므로 S. TyphimuriumL. monocytogenes와 경쟁적으로 생장하는 균이 있는 상태에 서 검출효율을 비교하였다(Table 3). S. TyphimuriumC. freundii는 유전적으로 유사한 O antigen을 가지고 있으며 그중에서도 S. enterica O59와 C. freundii O35가 유전적 으로 동일하고 S. enterica O30와 C. freundii의 F90의 구 조도 유사하다고 알려져 있다11). S. Typhimurium는 O antigen의 유전자의 서열을 통해 primer를 설계하여 검출 하는데, 3M MDA 2에서는 6개의 primer를 이용하여 target region 8곳에 인식 반응한다12). S. Typhimurium를 증균배 양할 때 쓰이는 BPW는 비선택적인 배지로 S. Typhimurium 보다 높은 수준으로 C. freundii가 존재할 때 두 가지 균 은 유전적으로 유사한 O antigen을 가지므로 6개의 primer 가 target region에 붙는 인식 반응이 정확히 이루어지지 않아 3M MDA 2 검출 결과에 영향을 미칠 수 있다. 따 라서 S. Typhimurium을 100 CFU/25 g수준으로 접종하고 C. freundii를 102 CFU/25 g수준으로 접종한 후 분리배지, real-time PCR과 3M MDA 2으로 검출하였다. S. Typhimurium 만을 접종한 처리구를 대조구로 설정하였는 데 육회, 육사시미 모두 세 가지 방법에서 큰 차이가 없 었다. 반면 S. TyphimuriumC. freundii를 같이 접종했 을 때 S. Typhimurium만 단독으로 접종한 처리구 보다 검 출이 잘 되지 않았다. 육사시미에서도 큰 차이는 없었으 나 분리배지에서 가장 검출이 잘 되었으며 PCR보다는 LAMP에서 더 민감한 수준으로 검출하였다.

    L. monocytogenesL. innocua와 같은 비병원성 Listeria spp.과 경쟁적으로 생장하는 특징이 있다. 비병원성인 Listeria spp.의 세대간 시간이 병원성 Listeria spp.보다 짧 기 때문에 두 가지가 같이 존재할 경우 병원성 L. monocytogenes가 검출되지 않을 수도 있다13). L. innocuaL. monocytogenes보다 높은 수준으로 존재할 때 마찬 가지로 6개의 primer가 target region에 붙는 인식 반응이 정확히 이루어지지 않아 3M MDA 2 검출 결과에 영향을 미칠 수 있다. 따라서 시료에 L. monocytogenes을 100 CFU/ 25 g수준으로 접종하고 L. innocua를 102 CFU/25 g수준으 로 접종하여 분리배지, real-time PCR과 3M MDA 2를 이 용한 검출실험을 실시하였다. 그 결과 분리배지에서 가장 검출이 잘 되었으며 L. monocytogenesL. innocua를 같이 접종했을 때 검출에 영향을 미치기는 했지만 육회와 육사 시미 모두 3M MDA 2에서는 큰 차이가 나타나지 않았다. 그러나 real-time PCR에서는 대조구보다 검출이 잘 되지 않았는 데, 이는 L. monocytogenesL. innocua에 의해 생장이 저해되었기 때문으로 생각되었다. 따라서 LAMP 가 PCR에 비해 DNA 증폭 저해 영향을 덜 받았던 것으 로 생각되었다.

    결과적으로 real-time PCR 보다 3M MDA 2가 더 검출 효율이 높았음을 알 수 있었으며, 또한 분리배지가 가장 검출이 잘 되지만 3M MDA 2와도 큰 차이가 없음을 확 인하였다. 분리배지를 이용하는 방법은 최소 일주일의 시 간이 소요되어 신속검출 목적으로 사용할 수 없는 단점이 있다. 그러나 이에 비해 3M MDA 2는 enrichment 과정과 간단한 lysis protocol을 통해 25분 이내로 샘플의 양성 반 응을 확인할 수 있기 때문에 신속검출 목적에 적합하다. 또한 3M MDA 2는 ISO, AOAC OMA와 같은 국제적인 공인시험법으로 인증된 방법으로서 신뢰할 수 있는 결과 를 보여주므로 식중독세균의 신속 검출에 의한 선제적인 식품안전 관리 수단으로 활용될 수 있음을 알 수 있었다.

    국문요약

    본 연구에서는 한국 전통 식품에서 Salmonella Typhimurium 와 Listeria monocytogenes의 검출에 대하여 LAMP에 기 반한 3M Molecular Detection Assay 2 (3M MDA 2)와 식 품공전에 등재된 분리배지, real-time PCR의 검출 성능을 비교하고자 하였다. 육회와 육사시미에 100–104 CFU/25 g 의 수준으로 S. TyphimuriumL. monocytogenes을 각각 접종하였다. Citrobacter freundiiListeria innocua는 S. Typhimurium와 L. monocytogene의 검출에 영향을 주는 균 으로 사용하였다. S. TyphimuriumL. monocytogenes만 100–104 CFU/25 g수준으로 접종한 모든 시료에서는 분리 배지, real-time PCR과 LAMP에서 양성으로 검출되었다. C. freundiiL. innocua를 같이 접종한 경우에서 부분적으로 양성이 나타났다. 육회와 육사시미에 대하여 real-time PCR 보다 3M MDA 2가 더 검출효율이 높음을 알 수 있었다. 분리배지가 가장 검출효율이 높았지만 3M MDA 2와 큰 차 이가 없었다. 배지를 사용하는 방법은 최소 일주일의 시간 이 소요되고 PCR의 경우 inhibitor의 영향을 많이 받아 정 확한 검출이 어려운 점이 있다. 그러나 LAMP에 기반한 3M MDA 2는 enrichment 후 다음 날 간단한 protocol을 통해 25분 이내로 샘플의 양성 반응을 확인할 수 있어 식중독균 에 대해 신속하고 정확한 검출이 가능한 것으로 판단되었다.

    Figure

    Table

    Comparison of the 3M Molecular Detection Assay 2 - Salmonella and Korea Standard Food Codex (KFSC) Method for the detection of Salmonella Typhimurium in Yuk-hwe and Yuk-Sashimi

    Comparison of the 3M Molecular Detection Assay 2 – Listeria and Korea Standard Food Codex (KFSC) Method for the detection of Listeria monocytogenes in Yuk-hwe and Yuk-Sashimi.

    Comparison of the 3M Molecular Detection Assay- Salmonella and Listeria and Korea Standard Method for the detection of Salmonella Typhimurium and Listeria monocytogenes in Yuk-hwe and Yuk-Sashimi when non-target bacteria is present

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