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ISSN : 1229-1153(Print)
ISSN : 2465-9223(Online)
Journal of Food Hygiene and Safety Vol.34 No.6 pp.519-525
DOI : https://doi.org/10.13103/JFHS.2019.34.6.519

Analytical Method Development for Determination of Coenzyme Q10 by LC-MS/MS in Related Health Functional Foods

Jin Hee Lee, Mihyune Oh*
Imported Food Analysis Division, Gyeongin Regional Office of Food and Drug Safety, Incheon, Korea
Correspondence to: Mihyune Oh, Senior scientific officer, Gyeongin Regional office of Food and Drug Safety, 137, Juanro, Michuhol-gu, Incheon 22133, Korea Tel: 82-32-450-3361, Fax: 82-32-442-4622 Email: mihyuneoh@korea.kr
September 20, 2019 October 2, 2019 October 28, 2019

Abstract


The Ministry of Food and Drug Safety (MFDS) is amending its test methods for health functional foods (dietary food supplements) to establish regulatory standards and specifications in Korea. In this regard, we are continuing our research on analytical method development for the items listed in the Korean Health Functional Food Codex. In this study, we have developed a sensitive and selective test method that could simultaneously separate and determine coenzyme Q10 based on liquid chromatographic-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). Calibration curves showed linearity with a correlation coefficient (R2) of > 0.999 and the limits of detection (LODs) and limits of quantitation (LOQs) were in the range of 26.0 μg/L and 78.9 μg/L, respectively. The recovery results ranged between 98.6-107.0% at 3 different concentration levels with relative standard deviations (RSDs) less than 5%. The proposed analytical method was characterized with high resolution of the coenzyme Q10 and the assay was fully validated as well.



건강기능식품에서 LC-MS/MS를 이용한 코엔자임Q10 분석법 연구

이 진희, 오 미현*
경인지방식품의약품안전청 수입식품분석과

초록


    Ministry of Food and Drug Safety
    17161미래식057

    우리나라 건강기능식품은 2004년부터 건강기능식품에 관한 법률로 관리되고 있으며, 28종의 영양성분과 인삼 등 기능성원료 68종을 건강기능식품 공전에 수재하였다1). 2012년 건강기능식품의 생산 및 수입실적 규모는 2조 7,047 억원으로 전년대비 3.9% 성장하였다2). 시장규모 성장과 더불어 건강기능식품의 유형, 형태 등의 다양성이 증가하 고 있어 식품의약품안전처(이하 식약처)에서는 우수한 건 강기능식품이 제조·공급될 수 있는 환경을 조성하고 삶의 질 향상 등 국민 건강증진을 위한 다양한 정책과 제도를 마련하여 시행하고 있다.

    코엔자임Q10은 1957년 소의 심장에서 발견된 보조효소 이며 세포막에 결합되어 있는 전자전달계의 필수적인 지 질계 화합물이다3-7). 유비퀴논(ubiquinone) 또는 유비데카 레논(ubidecarenone)으로도 알려져 있고 비타민유사작용인 자, 비타민Q라고도 불린다. 물리적 특성으로는 황색의 결 정성 퀴논화합물이며, 냄새나 맛은 없고 지용성 비타민 E, K와 비슷한 화학구조를 가진 지용성 물질로서 물에 거의 녹지 않는다(Table 1). 생리적으로는 항산화, plasma membrane에서 지방과 산화 방지, 편두통 및 심혈관질환 완화 등의 효능이 알려져 있다8-12).

    건강기능식품공전에 고시된 코엔자임Q10은 아그로 박테륨 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens), 파라콕 커스 데니트리피칸스(Paracoccus denitrificans), 슈도모나 스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 등의 배양산물을 헥산, 아세톤, 이소프로필알코올, 초산에틸로 추출하고 이 를 농축 또는 정제하여 제조한다. 그 기능성은 “항산화· 높은 혈압 감소에 도움을 줄 수 있음”으로, 일일섭취량은 “코엔자임Q10으로서 90-100 mg”으로 기재되어 있다. 기능 성원료의 기능성분(또는 지표성분)의 함량은 코엔자임 Q10(Coenzyme Q10)이 900 mg/g 이상이 함유되도록 규정 되어 있으며, 시험법으로는 액체크로마토그래프(HPLC-UV) 를 이용한 정량법이 수재되어 있다13).

    최근에는 건강기능식품 시장에서 다양한 식품원료가 혼 합된 복합제품 개발이 활발하게 추진되고 있으며, 정제, 캡슐, 과립 등 12개 제형 이외 일반 식품 형태로도 확대 되고 있다. 이러한 다양한 제품 중 특정 기능성분의 함량 을 정확하게 측정하는 것은 건강기능식품의 품질관리를 위해서 반드시 요구되며 지속적인 시험법 개발이 필요하다.

    공정서 수재현황에 따르면, 코엔자임Q10은 건강기능 식품공전대한민국약전, 미국약전(USP), 유럽 약전(EP) 등에 등재되어 있다. 함량시험에서는 공통적으 로 코엔자임Q10을 헥산·무수에탄올(5 : 2)혼합액으로 초음 파진탕기로 추출용해하고 1% 무수염화제이철용액 및 무 수에탄올로 희석하여 시험용액을 조제한다. 시험용액과 표 준액은 액체크로마토그래프/자외분광광도검출기를 이용하 여 275 nm(건기공전, USP, EP) 또는 280 nm(대한약전)에 서 분석한다14-17).

    문헌으로 질량분석기(LC-MS/MS)를 이용한 분석법을 검 토한 결과 혈장, 혈청, 유제품, 담뱃잎, 버섯 중 코엔자임 Q10을 시험한 자료가 보고되어 있었다18-21). Giacomo 등 은 건강한 지원자들을 대상으로 식이조절한 후 혈장 중 코엔자임Q10을 메탄올과 헥산으로 추출하여 UPLC-MS/ MS로 분석한 결과를 보고하였다18). Ruiz-Jimenez 등은 혈청에서 ubiquinol-10과 ubiquinone-10을 LC-MS/MS로 분석하고 산화스트레스의 지표로 사용할 수 있는 비율을 제안하였다19). Yuangang 등은 담배 잎에서 코엔자임Q10 을 무수에탄올로 추출하고 LC-MS/MS를 이용한 분석법 을 제안하였다20).

    주로 혈장 등의 생체시료에서 분석한 경우는 있었으나 건강기능식품 등의 품질관리를 위한 분석법을 제안한 경 우는 없었다. 본 연구에서 다양한 복합제품의 건강기능식 품 중 LC-MS/MS를 이용하여 코엔자임Q10 정성 및 정량 분석법을 시도하였다.

    계속적으로 늘어나는 건강에 대한 관심과 심혈관계 질 환 등으로 우리나라에서 뿐 아니라 일본, 미국 등에서도 건강기능식품 코엔자임Q10 소비가 해마다 늘어나고 있다. 이에 따라 다양한 제품이 개발되고 있으며 광범위하고 다 양한 매트릭스에서 정확하게 분석하는 정성·정량 분석법 개발이 요구되고 있다.

    이에 본 연구에서는 다양한 매트릭스와 다성분 복합제 품 등을 고려한 코엔자임Q10 분석법을 연구개발 하였으 며, 그 결과를 토대로 건강기능식품 품질관리의 효율성 및 신뢰성을 확보하고 국민건강에 이바지하고자 하였다.

    Materials and Methods

    실험재료

    시험법 적용성평가를 위하여 국내에서 건강기능식품으 로 유통되고 있는 코엔자임Q10 캡슐 제품 14건을 구입하 여 검체로 사용하였다. 대상제품은 코엔자임Q10 기능성 원료를 주원료로 함유하며 그 기능성과 함량을 건강기 능식품 표시기준1)에 따라 표기한 것으로 하였다.

    정확도를 위한 회수율시험에서는 제품에 사용되는 부형 제의 영향을 확인하기 위하여 코엔자임Q10을 함유하지 않 은 건강기능식품으로 비타민 C 함유 제품을 선정하고 구 입하여 시험에 사용하였다.

    표준품 및 시약

    본 연구에 사용한 표준물질 코엔자임Q10(coenzyme Q10) 과 개미산은 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)사의 제 품을 사용하였고, 아세토니트릴, 이소프로필알콜은 Merck 사(Darmstadt, Germany)로부터, 이동상조제용으로는 HPLC 급으로 구입하여 사용하였다.

    분석장비

    시험분석을 위해 사용된 액체크로마토그래프-질량분석 기(LC-MS/MS)는 Waters사(Milford, MA, USA)의 ACQUITY UPLC System이 결합된 QUATTRO MICRO tandem 사중극자 질량분석기를, 분석용 칼럼으로는 Acquity UPLC® BEH C18(100 mm × 2.1 mm(i.d), 1.7 μm, waters) 를 사용하였다.

    표준용액의 조제

    코엔자임Q10 표준물질 10 mg을 정밀히 달아 10 mL 부 피플라스크에 넣고 헥산 · 무수에탄올(5 : 2)혼합액으로 용 해한 후 표준원액으로 하였다. 표준원액을 희석용매를 이 용하여 적절하게 희석하여 사용하였다. 희석용매는 헥산 · 무수에탄올(5 : 2)혼합액과 이동상을 10 : 90으로 혼합하 여 사용하였다.

    시험용액의 조제

    균질화한 시료를 코엔자임Q10으로서 약 10 mg 해당량 을 정밀하게 달아 헥산·무수에탄올(5 : 2)혼합액 100 mL에 녹이고, 희석용매를 이용하여 적절하게 희석한 후 0.2 μm 멤브레인 필터로 여과한 것을 시험용액으로 하였다. 희석 용매는 표준액 제조에 사용된 것과 동일한 것을 사용하였다.

    액체크로마토그래프-질량분석기(LC-MS/MS) 분석조건

    코엔자임Q10에 관한 질량분석법(LC-MS/MS) 논문을 검 토하여 기기분석조건을 확립하였다. 분석칼럼은 모두 C18 으로 치환된 역상칼럼을 사용한 것을 확인하였으며 본 시 험법에서도 동일한 것을 사용하였다18-21).

    본 연구에서 건강기능식품 중 LC-MS/MS를 이용하여 코엔자임Q10 분석법을 시도하는 경우로 시험용액 조제 방 법 선정에 참고자료가 부족하여 어려움이 있었다.

    액체크로마토그래피법(LC) 또는 분석대상은 다르지만 LC-MS/MS에 사용된 방법 등을 문헌 등을 참고하여 3가 지 혼합용매를 대상으로 예비시험을 실시하였다. 첫 번째 로는 문헌에 보고된 에탄올 및 헥산에 대하여 각각 검토 하였다19,22). 두 번째는 건강기능식품공전에 수재된 LC법 조제방법을 사용하였다14). 검체를 헥산·무수에탄올(5 : 2) 혼합액으로 초음파진탕기로 추출용해하고 1% 무수염화제 이철용액 및 무수에탄올로 희석하여 시험용액을 조제하였 다. 마지막으로는 두 번째 방법과 동일하게 검체를 헥산· 무수에탄올(5 : 2)혼합액으로 초음파진탕기로 추출 용해하 였다. 일반적인 LC-MS/MS 분석조건을 고려하고 수차례 예비실험을 통하여 헥산·무수에탄올(5 : 2)혼합액과 이동 상을 10 : 90으로 혼합한 용액을 희석용매로 하여 검토하 였다.

    코엔자임 Q10을 LC-MS/MS를 이용하여 분석하기 위하 여 여러 종류의 이동상이 보고되어 있었다18-21). 최적의 이 동상을 선정하고자 총 6가지 이동상; ① 5 mM ammonium formate in methanol, ② methanol : ethanol : isopropyl alcohol (70 : 15 : 15), ③ 2 mM ammonium acetate in methanol, ④ 5mM ammonium formate in isopropyl alcohol : methanol (50 : 50), ⑤ acetonitrile : isopropyl alcohol : Formic acid(90 : 10 : 0.1), ⑥ 0.5% Formic acid in acetonitrile : 0.5% formic acid in isopropyl alcohol (50 : 50)에 대하여 비교 실험하였다.

    이밖에도 기기분석조건을 확립하기 위하여 문헌검토 및 예비시험을 실시하였고, 코엔자임Q10의 모분자에서 형성 된 딸이온들에 대한 감도를 비교분석하여 정량이온과 정 성이온을 선정하였다.

    액체크로마토그래프-질량분석기(LC-MS/MS) 분석법 유효 성 검증

    LC-MS/MS를 이용한 코엔자임Q10분석법을 확립한 후 에는 시험법에 대하여 유효성을 검증하였다. 특이성 (specificity), 직선성(linearity), 검출한계(LOD, limit of detection), 정량한계(LOQ, limit of quantification), 정확도 (accuracy), 정밀도(precision), 실험실간 교차검증에 대해 검증하였으며, AOAC 시험법 검증 가이드라인에서 제시 하는 방법을 참고하였다23).

    직선성은 표준용액 62.5, 125, 200, 400, 600 μg/L을 이 용하여 유효성을 검증하였다. 정량한계와 검출한계는 직 선성을 구하기 위하여 사용한 검량선을 3회 반복측정하여 기울기의 평균값(S)과 y절편의 표준편차(σ)를 이용하여 구 하였다. 검출한계는 3.3 σ/S, 정량한계는 10 σ/S로 산출하 였다.

    정확도(회수율)를 확인하기 위하여 코엔자임Q10을 함유 하지 않은 비타민C 제품을 기질바탕시료(matrix blank: 기 질 포함, 코엔자임Q10 불포함)로 선정하여 회수율을 검토 하였다. 기질바탕시료에 코엔자임Q10 표준용액을 각각 150, 300, 450 μg/L이 되도록 첨가하여 3회 반복 실험을 하였다.

    검체량의 변화에 대한 반복 정밀도와 실험실간 정밀도 를 확인하기 위하여 검체 100 mg당 코엔자임Q10 20 mg 을 함유하는 유통제품을 구입하여 이용하였다. 반복성 시 험에서는 코엔자임Q10으로서 10 mg, 20 mg, 30 mg에 해 당하도록 검체 각각 50 mg, 100 mg, 150 mg을 취하여 5 회 반복 측정하였다. 실험실 2 곳에서 검체를 각각 5회 반 복 측정하여 실험실간 정밀도를 확인하였다.

    또한 유통·판매되고 있는 코엔자임Q10 함유 건강기능식 품을 14건을 구입하여 본 연구에서 확립한 질량분석법에 대한 적용성 시험을 실시하였다.

    Results and Discussion

    액체크로마토그래프-질량분석기(LC-MS/MS) 분석법 확립

    시험용액 조제방법으로는 3가지 혼합용매를 대상으로 검토하였다. 첫 번째로는 에탄올 및 헥산에 대하여 각각 검토하였다. 검체가 용해는 잘 되었으나 피크검출이 잘 되 지 않아 시험을 진행할 수 없었다. 두 번째로는 검체를 헥 산·무수에탄올(5 : 2)혼합액으로 초음파진탕기로 추출용해 하고 1% 무수염화제이철용액 및 무수에탄올로 희석하여 시험용액을 조제하였다. 이 경우도 역시 용해는 잘 되었 으나 피크의 감도가 낮아서 시험이 용이하지 않았다. 마 지막으로는 검체를 헥산·무수에탄올(5 : 2)혼합액으로 초 음파진탕기로 추출용해하고 헥산·무수에탄올(5 : 2)혼합액 과 이동상을 10 : 90으로 혼합한 용액을 희석용매로 하였 다. 이 경우 용해도 잘 되고 피크 검출도 용이하여시험용 액 조제 방법으로 선정하였다.

    코엔자임Q10을 LC-MS/MS를 이용하여 분석하기 위하 여 총 6가지 이동상에 대하여 검토하였다. ① 5 mM ammonium formate in methanol의 경우는 피크의 머무름 시간에 대한 재현성이 감소하였다. ② methanol : ethanol : isopropyl alcohol(70 : 15 : 15)과 ④ 5 mM ammonium formate in isopropyl alcohol : methanol(50 : 50) 에서는 피크감도가 낮아 검출이 용이하지 않았다. ③ 2 mM ammonium acetate in methanol과 ⑤ acetonitrile : isopropyl alcohol : Formic acid(90 : 10 : 0.1)에서는 피크 가 갈라지는 단점이 있었다. 마지막으로 ⑥ 0.5% Formic acid in acetonitrile : 0.5% formic acid in isopropyl alcohol(50 : 50)에서 피크의 머무름시간이 재현성 있고 잘 분리되었으며 낮은 농도까지 분석 가능하였다. 이상의 결 과로 ⑥ 0.5% Formic acid in Acetonitrile : 0.5% formic acid in isopropyl alcohol(50 : 50)을 이동상으로 선정하였 다(Table 3).

    이 외에도 질량분석기를 이용한 분석조건은 확립하기 위 하여 문헌검토 및 예비시험을 실시한 결과, ESI positive ionization mode를 사용하였고 코엔자임Q10의 모분자모분 자에서 딸이온들에 대하여 감도가 가장 크고 안정적으로 쪼개지는 이온을 선정한 결과 코엔자임Q10의 모분자 [M+H]+ = m/z 864 ion에서 m/z 197 ion으로 한 다음 정 량분석에서는 다중반응검지법(Multiple Reaction Monitoring, MRM)을 이용하여 분석을 수행하였다(Table 2).

    액체크로마토그래프-질량분석기(LC-MS/MS) 분석법 유효 성 검증

    특이성 및 직선성

    특이성을 확인하기 위하여 표준용액과 시험용액에서의 분리도 및 머무름 시간을 확인한 결과 동일한 위치에 코 엔자임Q10 단일피크가 특이적으로 측정되었다. 또한 코엔 자임Q10을 함유하지 않는 음성대조군을 선정하여 분석한 결과 크로마토그램 및 질량 스펙트럼에서 방해피크 등이 없음을 확인하였다(Fig. 1). 직선성(linearity)을 확인하기 위 하여 시료에서 코엔자임Q10이 검출되는 농도범위를 중간 값으로 설정하여 총 5개의 표준용액 농도; 62.5, 125, 200, 400, 600 μg/L에 대한 직선성을 검토하였다. 실험과정에서 나타날 수 있는 오차범위를 확인하기 위하여 각 농도에 대해서 3반복으로 수행하였으며, 실험결과 검량선의 상관 계수(R2)는 0.999이상의 높은 유의수준을 보였다. 이는 AOAC 가이드라인에서 제시하는 기준(R2>0.99)을 만족시 켰다.23)

    검출한계 및 정량한계

    직선성을 구하기 위하여 사용한 검량선을 3회 반복측정 하여 기울기의 평균값(S)과 y절편의 표준편차(σ)를 이용하 여 구하였다(Fig. 2). 3.3 σ/S를 검출한계(LOD)로 10 σ/S를 정량한계(LOQ)로 산출하였고, 그 결과 각각 26.0, 78.9 μg/ L이었다.

    정확도 및 정밀도

    정확도를 확인하기 위하여 코엔자임Q10을 함유하지 않 은 기질바탕시료에 표준물질을 150, 300, 450 ng/mL이 되 도록 첨가하였다. 그 결과 평균회수율은 98.6-107.0%, 상 대표준편차는 모두 3.0%이하로 관찰되었다(Table 4).

    반복성 시험에서는 코엔자임Q10으로서 10 mg, 20 mg, 30 mg을 함유하도록 검체를 취하여 5회 반복 측정하였다. 그 결과 각 농도의 상대표준편차는 각각 일내 4.0, 2.6, 1.5%이었고 일간에서는 2.3, 2.0, 1.9%이었다(Table 5).

    각 분석물에 대한 정확도 및 정밀도는 AOAC 가이드라 인에서 제시하는 기준(분석물 농도 1 μg/g일 때 회수율 범 위 75-120%, 상대표준편차 8%)에 모두 부합하였을 뿐만 아니라 높은 정확도와 정밀도를 확인할 수 있었다.

    실험실간 교차검증

    분석법의 유효성 확인을 위하여 실험실간 교차검증을 실시하였으며 코엔자임Q10 함량분석에 대한 상대표준편 차는 2.4%로 나타났다. 이는 AOAC 가이드라인에서 제 시하는 기준(분석물 농도 1 μg/g일 때 상대표준편차 16%) 에 적합한 결과로서 분석법의 일관성을 확인할 수 있었 다(Table 6).

    건강기능식품 제품에 대한 적용성 검토

    코엔자임Q10함유 건강기능제품 14건에 대하여 확립된 LC-MS/MS 분석법을 이용하여 실험한 결과, 검체는 표시 함량 대비 84.0-118.7%로 현행 기준 80.0-120.0%에 모두 적합하였다(Table 7). 이로써 본 시험법을 건강기능식품 제 품의 품질관리에 적용 가능한 것으로 나타났다.

    본 연구를 통하여 LC-MS/MS를 이용하여 건강기능식품 중 정성·정량가능한 코엔자임Q10 분석법을 확립하고 유효 성을 검증하였다. 이와 같은 신뢰성을 확보한 시험법은 원 료 및 단일제품과 함께 농도가 낮은 복합제품의 품질관리 에도 적용할 수 있을 것으로 사료된다.

    국문요약

    건강기능식품의 경우 단성분보다는 복합제품 개발이 우 선시되고, 12가지 기본제형이외에도 일반식품형태의 제품 으로 범위가 확대되고 있다. 이러한 제품에서 기능성(지 표)성분을 효율적으로 분석할 수 있는 방법에 대한 연구 가 필요한 실정이다. 복합제품 등에서 정성·정량 가능한 코엔자임Q10을 효과적으로 분석할 수 방법을 확립하기 위 하여 본 연구를 수행하였다. 액체크로마토그라프-질량분석 기(LC-MS/MS)를 이용하여 건강기능식품 중 코엔자임Q10 의 정성·정량시험법을 확립하였다. 확립된 시험법에 대해 특이성, 검출한계, 정량한계, 정확도, 정밀도에 대한 검증 을 통하여 유효성을 확인하였다. 또한 시중 유통검체 14 건을 확보하여 시험의 적용가능성도 검토하였다. 직선성 에서는 R2>0.999 이상임을 확인하였고, 검출한계 및 정량 한계는 각각 26.0 및 78.9 μg/L이었다. 또한 평균 회수율 은 98.6-107.0%로 나타났으며, 반복정밀도는 상대표준편 차 4.0%이하, 실험실간 재현성은 2.4%로 나타나 정확성, 재현성이 우수하였으며 이는 AOAC 가이드라인에서 제시 한 기준에 모두 적합한 수준이었다. 시중 유통 제품에 대 하여 실험한 결과 84.0-118.7%로 모두 적합하였다. 따라 서 본 연구에서 개발된 분석법은 건강기능식품 중 코엔자 임Q10의 정성·정량분석에 이용될 수 있으며, 우수한 품질 의 건강기능식품유통에 기여할 것으로 판단된다.

    Acknowledgement

    본 연구는 2017년도 식품의약품안전처 연구개발사업의 연구비 지원(17161미래식057)에 의해 수행되었으며, 이에 감사드립니다.

    Figure

    JFHS-34-6-519_F1.gif

    Representative MRM chromatograms of coenzyme Q10.

    JFHS-34-6-519_F2.gif

    Calibration curve of coenzyme Q10.

    Table

    Molecular Structure of coenzyme Q10

    Selected-ion of LC-MS/MS for coenzyme Q10

    Analytical conditions for the determination of coenzyme Q10

    Validation results (accuracy) of analytical method for the determination of coenzyme Q10 (n=5)

    Validation results (repeatability) of analytical method for the determination of coenzyme Q10 (n=5)

    Inter-laboratory validation results (reproducibility) of analytical method for the determination of coenzyme Q10 (n=5)

    The contents of coenzyme Q10 for circulated products by LC-MS/MS

    Reference

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