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ISSN : 1229-1153(Print)
ISSN : 2465-9223(Online)
Journal of Food Hygiene and Safety Vol.35 No.1 pp.6-12
DOI : https://doi.org/10.13103/JFHS.2020.35.1.6

Prevalence of Toxin Genes and Profiles of Antibitoc Resistance in Vibrio vulnificus Isolates from Fish, Fish Tanks, and Patients

Yeon-Hee Yoon1, Sook Park1, Jin Young Kim1, Ye Ju Lee1, Doo-Young Jeon1, Gyeong Cheol Choi1, Jong Soo Park1, Jung-Beom Kim2*
1Microbiology Division, Health and Environment Research Institute of Jeollanam-Do, Muan-gun, Korea
2Department of Food Science and Technology, Sunchon National University, Suncheon, Krea
Correspondence to: Jung-Beom Kim, Department of Food Science and Technology, SunChon National University, 255 Jungangro, Suncheon, Jeonnam 57933, Korea Tel: +82-61-750-3259, Fax: +82-61-750-3208 E-mail: okjbkim@sunchon.ac.kr
November 24, 2019 December 2, 2019 December 10, 2019

Abstract


Prevalence of toxin genes and profiles of antibiotic resistance in Vibrio vulnificus were investigated for prevention of Vibrio sepsis and selection of effective antibiotics. A total of 23 V. vulnificus strains were isolated from Vibrio sepsis patients, fish, and water samples collected from fish tanks in restaurants in Jeonnam province during 2015-2017 period. Prevalence of toxin genes including, RtxA, viuB and vvhA were assessed and susceptibilities to 15 different antibiotics were determined. As a result of the toxin gene profile, the RtxA toxin gene was detected in 19 (82.6%) out of 23 strains, and vvhA and viuB toxin genes were positive in all strains. These results showed that V. vulnificus tested in this study possessed at least one more toxin gene, and the toxin gene detection rate was higher than in previous reports. Therefore, there is always a risk of Vibrio sepsis through eating fish or having contact with aquarium water at seafood restaurants. Especially, it was deemed necessary to provide preventive education about Vibrio sepsis for workers in such restaurants. The results of antibiotic susceptibility tests presented 94.4% resistance to cepoxitin antibiotics but all strains showed susceptibility to 14 kinds of antibiotics including chloramphenicol and tetracycline. The currents antibiotic therapy using chloramphenicol and teteracycline against Vibrio sepsis was judged to be useful.



어류, 수족관수 및 환자에서 분리된 Vibrio vulnificus의 독소유전자 분포 및 항생제 내성

윤 연희1, 박 숙1, 김 진영1, 이 예주1, 전 두영1, 최 경철1, 박 종수1, 김 중범2*
1전라남도보건환경연구원 미생물과
2순천대학교 식품공학과

초록


    Jeollanam-do Institute of Health and Environment

    병원성 비브리오균에는 Vibrio cholera, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus 등이 있으며 우리나라 해안지 역에 광범위하게 분포하여1), 해수, 갯벌, 어패류 등에 서 식하고 있다2). V. vulnificus는 해수 온도가 15°C 이상으로 상승하는 초여름부터 활발하게 증식하여 여름부터 늦가을 까지 해양 생태계에 상존한다3). V. vulnificus는 그람음성, 운동성이 있는 호염성 간균으로, 수산물 섭취에 따른 사 망사고의 95% 이상이 관련된 것으로 보고4)되고 있다. V. vulnificus 균주에 의한 질병은 피부가 불에 덴 것 같은 증 상을 나타내 괴저병이라고 지칭되었으나, 1981년 V. vulnificus가 원인균주임이 밝혀져5)Vibrio 패혈증으로 명명 되었다. V. vulnificus는 전 세계적으로 하절기 주요 식중독 원인균주로 인간에게 패혈증을 일으키는 유해균으로 보고 되고 있다5,6). V. vulnificus의 주요 감염경로는 간 질환이 있거나 면역력이 약해진 사람이 오염된 어패류를 생식하 여 감염되는 경우와 피부상처를 통한 감염이 보고되고 있 다7,8). V. vulnificus 감염 증상으로는 피부병변과 함께 발열, 복통, 설사 등의 증상이 나타난다9). 2013년부터 2017년까 지 5년간 전국에서 발생한 비브리오 패혈증 환자 256명 중 120명(46.9%)이 사망하는 등 매년 비브리오 패혈증환 자와 사망자가 발생하고 전남 해안지역에서 환자발생 빈 도가 가장 높은 것으로 보고10)되고 있다.

    V. vulnificus 균주의 주요 독소유전자로는 세포독성을 나 타내는 Rtx, siderophore 생성하는 viu, 용혈작용을 나타내 는 vvh 등이 알려져 있으며, 임상 분리균주와 환경 분리 균주 간에 16S rDNA의 sequence polymorphism이 존재한 다고 보고되고 있다11-13). 또한 multiplex PCR를 이용한 16S rDNA 유전자의 증폭산물에 따라 임상형과 환경형으로 분 류되고 있다11-13). 우리나라의 경우 패혈증이 발생하면 저 혈압 등의 쇼크증상이 나타나는 원발성 감염이 대부분으 로 발병 후 2-3일 이내에 50-80% 이상이 사망한다14-16). 따 라서 비브리오 패혈증 감염에 따른 사망을 방지하기 위해 환자가 가장 많이 발생하는 전남 해안에서 분리된 V. vulnificus 균주의 독소유전자 분포 및 항생제 내성 분석이 필요하다 하겠다. 그러나 현재까지 연구를 살펴보면 멕시 코 만 해수와 조개류에서 분리된 V. vulnificus 균주의 독 소유전자 분석17), 스웨덴 남부해안에서 분리된 V. vulnificus 균주의 독소유전자 분석18), V. vulnificus 균주가 생산하는 RTX 독소의 위해성19), V. vulnificus 균주의 vvh 독소유전 자20) 등 국외 연구에 비하여 국내에서는 인천지역에서 분 리된 V. vulnificus 균주의 독수유전자 특성과 항생제 내성 분석9), 2014년부터 2015년 까지 비브리오 패혈증 환자에 게서 분리된 V. vulnificus 균주의 유전적 다양성21) 등에 한 정되어 있다.

    따라서 본 연구에서는 2015년부터 2017년까지 3년간 전 남지역에서 발생한 비브리오 패혈증 환자로부터 분리된 V. vulnificus 균주와 전남지역에서 채취된 어패류 및 횟집 수 족관수에서 분리된 V. vulnificus 균주를 대상으로 Rtx, viu, vvh 등의 독소유전자 분포와 항생제 감수성을 분석하여 비 브리오 패혈증 환자 발생시 치료에 기여하고자 하였다.

    Materials and Methods

    실험균주

    본 실험에 사용한 V. vulnificus 균주는 2015년부터 2017 년까지 전남지역 어류에서 분리된 2균주, 횟집 수족관수 에서 분리된 3균주, 비브리오 패혈증 환자로부터 분리된 18균주, 총 23균주를 대상으로 하였다. 실험에 사용된 V. vulnificus 균주는 비브리오 패혈증 유행예측사업을 통해 분리 동정되어 -70°C 냉동고에 보관되어 있었으며, 보관 균주를 1%-NaCl 함유 TSB (tryptic soy broth, Oxoid, London, England)에 접종하여 37°C에서 24시간 3회 배양 하여 재활성화 하였다.

    생화학적 동정

    보관된 균주가 V. vulnificus 균주임을 재확인하기 위하 여 생화학 동정을 실시하였다. 1%-NaCl 함유 TSB에서 재 활성화 된 균액 한 백금이를 TCBS (thiosulfate citrate bilesalt sucrose, Oxoid, England)배지에 획선 도말하여 37°C 에서 24시간 배양하였다. 배양결과 녹색집락을 선택하여 Chromagar Vibrio agar (CHROMagar, Paris, France)에 도 말하여 37°C에서 24시간 배양한 후 파란색 집락을 선택하 여 1%-NaCl 함유 TSA (tryptic soy agar, Oxoid)에 계대 배양하였다. TSA 배지에서 순수 분리된 한 개 집락을 선 택하여 DensiCHEK instrument (Biomerieux, Marcyl'Etoile, France)를 이용하여 McFarland No. 0.6으로 현탁 하여 접종균액을 제조하였다. 접종균액을 Vitek GN카드에 접종한 후 Vitek2 system (Biomerieux)를 이용하여 V. vulnificus 균주를 동정하였다.

    DNA 추출

    순수 분리된 V. vulnificus 균주 한개 집락을 선택하여 멸 균증류수 1 mL가 들어 있는 microcentrifuge tube에 현탁 하여 12,000 rpm (Smart R17, Hanil scientific, Gimpo, Korea)에서 5분간 원심분리 하였다. 원심분리한 후 상층액 을 제거하고 멸균증류수 200 μL을 첨가하여 재현탁 시켜 99°C 히팅블럭(HB-96D, Daihan Scientific, Wonju, Korea) 에서 10분간 가열하였다. 가열 후 2분간 얼음 위에 정치 시킨 후 12,000 rpm에서 5분간 원심분리 하여 상층액을 conventional PCR과 real-time PCR의 주형 DNA로 사용하 였다.

    Conventional PCR

    V. vulnificus 균주의 독소유전자 중 siderophore receptor 생성에 관여하는 viuB 유전자와 resiniferatoxin를 분비하는 RtxA 유전자를 대상으로 하였다. 독소유전자 중 viuB 유 전자 검출을 위한 primer 염기서열은 Bhattacharyya의 보 고22)를 바탕으로 제작하였으며, RtxA 유전자 검출을 위한 primer는 국립보건연구원에서 Kwak 등23)이 보고한 GenBank database (HQ391952-HQ391988)를 바탕으로 primer-blast (https:www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast)로 설계한 염 기서열을 이용하였다(Table 1). PCR primer는 GenoTech (Daejeon, Korea)에 의뢰하여 합성하였으며, PowerChekTM 2X Premix III strip kit (Kogenbiotech, Seoul, Korea)를 이 용하여 실험하였다. PCR 반응은 SimpliAmpTM Thermal Cycler (Applied Biosystems, Singapore)를 이용하여 95°C 에서 10분간 열변성한 후 95°C 30초, 58°C 30초, 72°C 60 초를 30회 반복한 후 최종적으로 72°C에서 10분간 PCR 을 실시하였다. V. vulnificus 균주의 독소유전자를 확인하 기 위해 PCR product 3 μL를 2% agarose gel 상에 로딩 하여 110 V에서 40분간 전기영동 하였다.

    Real-time PCR

    V. vulnificus 균주의 vvhA 독소유전자를 확인하기 위해 PowerChekTMVibrio 4-plex Real-time PCR kit (Kogenbiotech, Seoul, Korea)를 이용하여 확인하였다. ABI 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster city, CA, USA)을 사용하여 50°C에서 2분, 1 cycle, 95°C에서 10분, 1 cycle 반응시킨 후, 95°C에서 15초, 60°C 에서 60초를 40 cycle을 반응시켰다. 분석결과는 제조자의 기준에 따라 Ct 값이 33 이하에서 증폭이 나타났을 경우, 비브리오 패혈증균의 vvhA 유전자가 검출된 것으로 판정 하였다.

    항생제 감수성 실험

    V. vulnificus 균주의 항생제 감수성 실험은 제조사가 제시 하는 방법에 따라 AST-N169 card (Biomerieux)와 Vitek2 system을 이용하여 실험하였다. 분리 보관된 V. vulnificus 균 주를 1%-NaCl 함유 TSA (tryptic soy agar, Oxoid)에 배양한 후 한 개의 집락을 선택하여 DensiCHEK instrument (Biomerieux)를 이용하여 McFarland No. 0.6으로 현탁하였 다. 균주 현탁액과 Vitek2 system (Biomerieux)를 이용하 여 V. vulnificus 균주의 항생제 감수성을 실험하였으며, 감 수성, 중간내성 및 내성의 판단은 Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)의 기준에 따라 판정하였다24). 실 험에 사용된 항생제의 종류는 ampicillin, amoxicillin/ clavulanic acid, ampicillin/sulbactam, cefazolin, cefotetan, cefoxitin, ceftriaxone, imipenem, amikacin, gentamycin, nalidixic acid, ciprofloxacin, tetracycline, chloramphenicol, trimethoprim/sulfamethoxazole 등 15종을 사용하였다.

    Results and Discussion

    V. vulnificus의 독소유전자 분석

    전라남도 지역의 어류, 횟집 수족관수 및 환자에서 분 리된 V. vulnificus 23균주를 Vitek2 system을 이용하여 동 정한 결과 모두 V. vulnificus로 동정되었다. V. vulnificus 균주임이 확인된 23균주에 대하여 PCR과 Real-time PCR 을 이용하여 독소유전자(RtxA, viuB, vvhA) 분석을 실시하 였다(Table 2). PCR 실험결과 총 23균주 중 19균주(82.6%) 에서 470 bp 밴드를 확인하여 RtxA 독소유전자를 보유한 것으로 나타났으며, 실험에 사용된 23균주 모두에서 505 bp 밴드를 나타내어 viuB 독소유전자를 보유한 것으로 나 타났다. 또한 vvhA 독소유전자를 확인하기 위한 real-time PCR 결과는 실험한 23균주(100%) 모두 30 이하의 Ct 값 을 나타내어 vvhA 독소유전자를 보유하고 있는 것으로 나 타났다. 어류, 횟집 수족관수 및 환자 등 분리원에 따른 V. vulnificus균의 독소유전자 분포는 Table 3에 나타내었으 며, 독소유전자 중 viuBvvhA 유전자는 분리원에 따른 구분 없이 모두 100% 검출되었다. 그러나 독소유전자 중 RtxA 유전자는 횟집 수족관수에서 분리된 2균주에서만 모 두 검출되었고 어류에서 분리된 3균주 중 1균주(33.3%), 패혈증 환자에서 분리된 18균주 중 16균주(88.9%)에서만 검출되었다.

    V. vulnificus의 병원성은 혈청 살균작용25), 탐식세포 내 성 capsule 형성26), 혈중 Fe을 포획하는 siderophore 생성 능, cytolysin27,28) 등 여러 독성인자들이 복합적으로 작용 한다29). V. vulnificus의 주요 병원성 인자로 알려진 독소유 전자는 Rtx, vvh, viu의 등이 있다,31). V. vulnificus 독소유 전자 중 Rtx는 패혈증을 일으키는데 중요한 역할을 하는 것으로 보고21)되고 있으며, Rtx 독소유전자 검출율은 임상 분리균주가 76.0%, 환경 분리균주가 76.5%로 보고21)되고 있다. 본 실험결과 총 23균주에 대한 Rtx 독소유전자 검 출율은 82.6%로 Hong 등의 보고21)에 비해 다소 높은 양 성율을 나타내었으나, 어류의 경우 33.3%로 낮은 검출율 을 나타내었고, 횟집 수족관수의 경우 100%의 검출율을 나타내었다. 이러한 결과는 기존 보고에 비해 어류 분리 V. vulnificus 균주의 경우 Rtx 독소유전자 검출율이 매우 낮은 결과이고, 횟집 수족관수 분리 V. vulnificus 균주의 경우 매우 높은 결과이나 실험대상 균주가 5균주로 매우 적어 지속적인 V. vulnificus 감시사업을 통해 다수의 균주 를 대상으로 한 실험이 필요한 것으로 판단된다.

    V. vulnificus 독소유전자 중 vvh 유전자는 cytolysinhemolysin을 생산하여 숙주세포로 침투하여 세포를 용혈 시키는 독소31,32)이고, viu 독소유전자는 혈액 중 Fe을 포 획하는 siderophore 생성하는 독소유전자로서 siderophorehydroxamate형, phenolate형, vulnibactin형이 보고되고 있다 14). 실험결과 어류, 횟집 수족관수 및 환자에서 분리된 23 균주의 V. vulnificus에서 vvhAviuB 독소유전자가 모두 검출되었다. 이러한 결과는 패혈증 환자에서 분리된 V. vulnificus 균주가 환경에서 분리된 균주에 비해 siderophore receptor 생성에 관여하는 viu 독소유전자가 높게 검출되었 다고 보고12)V. vulnificus로 동정된 209주에 대해 독소 유 전자 PCR를 실시하였을 때 206주(98.6%)에서 vvh 독소유 전자 검출되었다고 보고9)와 유사한 결과를 나타내었다. V. vulnificus 감염에 따른 패혈증은 간 손상 환자에게서 많은 발병하고 있으며, 그 기작에 관해 아직까지 명확하게 규명 되지 않았지만 혈중 Fe 농도와 밀접한 관계가 있는 것으 로 보고26)되고 있다. 이러한 결과를 종합하여 볼 때 어류, 횟집 수족관수, 환자에게서 분리된 V. vulnificus 균주 모두 가 1개 이상의 독소유전자를 보유하고 있어 하절기 생선회 섭취 시 주의가 요망되고, 횟집 수족관수에서 분리된 V. vulnificus는 3개 독소가 모두 검출되어 수족관수의 적절한 관리가 필요한 것으로 나타났다. 특히 수족관수와 항시 접 촉하는 횟집 종사자의 경우 상처를 통한 패혈증 감염의 위 험성이 상존하고 있어 교육이 필요한 것으로 판단된다.

    V. vulnificus의 항생제 감수성

    V. vulnificus에 대한 항생제 내성 실험결과는 Table 4에 나타내었다. 실험결과 cefoxitin 항생제에 18균주 중 17균 주(94.4%)가 내성(resistance)을 나타내어 실험에 사용한 항 생제 중 가장 높은 내성을 나타내었으며, 나머지 1균주는 중등도 내성(intermediate)을 나타내었다. 실험에 사용된 V. vulnificus 18균주 모두 chloramphenicol과 tetracycline 등 14종의 항생제에 감수성(susceptibility)을 나타내었다. 이러 한 결과는 2014년에서 2015년 전남지역 해수 및 갯벌에 서 분리된 V. vulnificus 균주에 대한 항생제 내성 실험결 과 cefoxitin에 85.7%, ampicilln에 14.3% 내성을 나타내었다 는 보고33)와 2001년에 분리된 V. vulnificus 균주에 대한 항 생제 실험결과 chloramphenicol, nalidixic acid, tetracycline 항 생제에 92.4%까지 감수성을 나타내었다는 보고34)와 유사 한 결과를 나타내었다. 그러나 인천지역에서 2004년부터 2006년까지 분리된 V. vulnificus 균주의 경우 cefoxitin 항 생제에 대한 내성이 6.7%라는 보고9)와 비교 시 항생제 내 성이 증가하는 경향을 나타내어 지속적인 연구가 필요한 것으로 판단되었다. 또한 국내 발생 비브리오 패혈증 환 자의 경우 발병한지 2-3일 이내에 50-80% 이상이 사망한 다15,16)는 보고로 보와 비브리오 패혈증 환자 발생 시 chloramphenicol과 tetracycline 항생제를 사용하는 현 치료 법이9) 유용한 것으로 판단되었다.

    국문요약

    본 연구에서는 비브리오 패혈증 예방과 치료에 유용한 항생제를 제시하기 위해 V. vulnificus의 독소유전자 분포 와 항생제 내성을 분석하였다. 2015년부터 2017년까지 3 년간 전남지역에서 발생한 비브리오 패혈증 환자로부터 분리되어 보관된 18균주와 전남지역에서 채취된 어패류 및 횟집 수족관수에서 분리된 5균주, 총 23균주를 대상으 로 하였다. 실험에 사용된 V. vulnificus 23균주 모두 V. vulnificus로 재확인되었다. V. vulnificus 균주의 독소유전자 를 분석한 결과, 23균주 중 19균주(82.6%)에서 RtxA 독소 유전자가 확인되었고, 23균주 모두에서 viuBvvhA 독소 유전자가 검출되었다. 이러한 결과는 독소유전자의 검출 율이 기존 보고에 비해 높은 것이며, 실험에 사용한 모든 V. vulnificus 균주가 1개 이상의 독소유전자를 보유한 것 으로 생선회 섭취와 상처를 통한 비브리오 패혈증 감염의 위험성이 상존하고 있었다. 따라서 횟집 종사자 등에 대 한 비브리오 패혈증 예방 교육이 필요한 것으로 판단되었 다. V. vulnificus에 대한 항생제 내성 실험결과 cefoxitin 항생제에 94.4%가 내성을 나타내었고, chloramphenicol과 tetracycline 등 14종의 항생제에 감수성을 나타내었다. 비 브리오 패혈증 치료에 chloramphenicol과 tetracycline 항생 제를 사용하는 현 치료법이 유용한 것으로 판단되었다.

    Acknowledgement

    본 연구는 전라남도보건환경연구원의 지원으로 수행되 었기에 감사드립니다.

    Figure

    Table

    Primer sequences for detection of Rtx and viu toxin gene in Vibrio vulnificus

    Toxin gene profile of Vibrio vulnificus isolated from fish, aquarium water at raw fish restaurants and patients

    Detection rate of toxin gene in Vibrio vulnificus

    Antibiotic resistance profiles of Vibrio vulnificus patients

    Reference

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