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ISSN : 1229-1153(Print)
ISSN : 2465-9223(Online)
Journal of Food Hygiene and Safety Vol.35 No.3 pp.213-218
DOI : https://doi.org/10.13103/JFHS.2020.35.3.213

Development of Method for Determining 4-Hydroxy-L-isoleucine in Health Functional Foods by HPLC

Se-Yun Lee, Hee-Sun Jeong, Soo-Jung Hu, Hye-Young Lee, Jae-Myoung Oh*
Nutrition and Functional Food Research Team, National Institute of Food and Drug Safety Evaluation, Ministry of Food and Drug Safety, Cheongju, Korea
*Correspondence to: Jae-Myoung Oh, Nutrition and Functional Food Research Team, National Institute of Food and Drug Safety Evaluation, Ministry of Food and Drug Safety, Cheongju, Cheongbuk 28159, Korea Tel: +82-43-719-4404, Fax: +82-43-719-2500 E-mail: osm5810@korea.kr
March 13, 2020 March 28, 2020 May 7, 2020

Abstract


This study was conducted to develop a method of analysis for 4-hydroxy-L-isoleucine in the seed extract of fenugreek (Trigonella foenum graecum), a health functional food that contains dietary fiber. The analytical method for 4-hydroxy-L-isoleucine was derived with O-phthaldialdehyde reagent (OPA) and determined by HPLCPDA. The method was performed on a Capcell Pak C18 UG 120 column (4.6×250 mm, 5 μm) in isocratic elution mode using disodium phosphate and acetonitrile. The validation of the developed analytical method was conducted by evaluating several parameters; selectivity, linearity, limit of detection (LOD), limit of quantification (LOQ), accuracy and repeatability. Excellent linearity (R2=0.999) was observed for 4-hydroxy-L-isoleucine in the concentration range (5-100 μg/mL). Observed recoveries of these compounds were found to be between 91.7 and 96.4%. Precision was between 0.2 and 2.4% relative standard deviation (%RSD).



건강기능식품에서 HPLC를 이용한 4-Hydroxy-L-isoleucine 분석법 연구

이 세윤, 정 희선, 허 수정, 이 혜영, 오 재명*
식품의약품안전처 식품의약품안전평가원 영양기능연구팀

초록


    Ministry of Food and Drug Safety
    19161미래안054

    최근 소비자 요구에 따라 다양한 기능성이 포함될 수 있도록 여러 가지 건강기능식품 기능성 원료가 혼합되어 제조되는 경우가 많아지고 있으며, 동일한 지표성분을 가 지고 있는 기능성 원료 혹은 동일한 성분을 가지고 있는 기타원료가 혼합되어 제조될 수 있는 가능성도 높아졌다. 이에 효율적이고 신뢰성 있는 사후관리 등 기준·규격 관 리를 위해 고시형 건강기능식품(68종)의 지표성분에 대한 적합성 검토를 실시하였고, 2018년 연구사업을 통해 호로 파종자식이섬유가 그 중 하나로 설정되었다.

    호로파(Trigonella foenum graecum)는 인도, 아프리카 지 중해에서 광범위하게 재배되는 한해살이 콩과 식물로서, 호로파의 종자는 인도와 중국에서 약초 그리고 향신료로 오랫동안 사용되어 왔다1). 호로파종자는 단백질 및 식이 섬유 함량이 높아 식이보충제의 원료로 전 세계적으로 사 용되고 있으며2,3), 주요 구성성분으로 4-hydroxy-L-isoleucine, trigonelline, diosgenin 등이 있다4).

    특히, 4-hydroxy-L-isoleucine은 Trigonella 종에서만 발견 되는 성분으로 개별인정형 원료의 지표성분으로 설정된 바 있다. 4-hydroxy-L-isoleucine은 호로파종자 특유의 냄 새와 쓴맛을 나타나게 한다5). 이러한 4-hydroxy-L-isoleucine 은 isoleucine으로부터 합성된 아미노산 유도체로 항당뇨5), 항박테리아6), 항염증7) 그리고 항산화8) 효과가 있다고 보 고되었다.

    호로파종자식이섬유는 ‘식후 혈당상승 억제에 도움을 줄 수 있음’의 기능성을 인정받았다. 미국약전에서도 호로파 종자를 식이보충제의 원재료로 관리하고 있으며 지표성분 으로 4-hydroxy-L-isoleucine 0.2% 이상을 기준규격으로 정 하고 있다9). 미국약전 시험법 및 Catherine 등10)의 연구에 서 phenylisothiocyanate(PITC), O-phthaldialdehyede(OPA) 등의 유도체시약을 이용하여 액체크로마토그래피/자외부 흡광광도검출기 및 형광검출기로 4-hydroxy-L-isoleucine을 분석한다.

    이에 본 연구에서는 4-hydroxy-L-isoleucine 분석법을 검 토하고 시험법 검증 가이드라인11)을 참고하여 밸리데이션 을 수행한 후 국내에서 유통 중인 건강기능식품에 대한 적용성을 확인하여 최적의 분석법을 확립하고자 한다.

    Materials and Methods

    시약 및 재료

    4-Hydroxy-L-isoleucine의 표준품은 Boc scientific사 (Shirley, NY, USA)로부터 구입하였고 인산수소이나트륨과 인산이수소나트륨은 Sigma사(St. Louis, MO, USA), 아세 토니트릴은 Merck사(Whitehouse Station, NJ, USA)로부터 HPLC급으로 구입하여 사용하였다. 유도체화에 사용되는 borate buffer (Cas. 5061-3339)와 OPA reagent (Cas. 5061- 3335)는 Agilent Technologes (Santa Clara, CA, USA)로부 터 구입하여 사용하였다. 시료 전처리와 이동상에 사용되 는 물은 3차 증류수(Distilled water)로 18.0 MΩ 이상인 것 을 사용하였다. 시료는 호로파종자추출물을 기능성 원료 로 하는 건강기능식품 3건을 인터넷을 통해 구입하였다.

    표준용액 조제

    4-Hydroxy-L-isoleucine 10 mg을 정밀히 취하여 증류수 에 녹여 표준원액(100 μg/mL)으로 하고, 표준원액을 증류 수로 희석하여 5, 10, 20, 40, 60, 80, 100 μg/mL의 농도 로 희석하여 검량선 작성을 위한 표준용액으로 하였다.

    시험용액 조제

    4-Hydroxy-L-isoleucine으로서 1.5-3 mg을 50 mL 부피 플라스크에 정밀히 취하고 증류수를 가하여 시료를 녹인 다. 30분 동안 초음파 추출 후 실온에서 냉각하여 증류수 로 50 mL 정용한다. 증류수로 적절히 희석하여 0.45 μm 멤브레인 필터로 여과한다. 위의 용액 40 μL와 borate buffer 200 μL를 혼합 후 30초간 방치하고, OPA 용액 40 μL를 혼합 후 이를 시험용액으로 한다.

    최적분석조건 확립

    건강기능식품공전시험법의 액체크로마토그래피/자외부흡 광도를 이용한 아미노산분석법인 폴리감마글루탐산 제2법12) 을 참고하여 전처리 및 기기분석 조건을 변화시켜 최적의 표준화된 시험법을 확립하고자 하였다. 우선 이동상 용매 로 사용되는 20 mM 인산수소이나트륨과 90% 아세토니트 릴 비율 82:18을 비율 85:15, 90:10 으로 달리하여 비교 실험하였으며 전처리용매를 0.02 N 염산과 증류수로 비교 실험하였다. 시료량 비교를 위해 시료 채취량을 100, 150, 200 mg으로 비교 실험하였다.

    밸리데이션 방법

    특이성을 확인하기 위하여 표준품과 시료에서의 분리도 및 머무름 시간을 확인하였다. 직선성은 시료에서 성분이 검출되는 농도범위를 중간값으로 설정하여 총 7개의 농도 5, 10, 20, 40, 60, 80, 100 μg/mL를 검토하였으며, 표준용 액만을 이용하여 산출하였고, 시험 시 나타날 수 있는 오 차범위를 확인하기 위하여 각 농도에 대해서 3반복 실험 을 수행하였다. 정확도는 표준물질 첨가법을 이용하여 비 타민 C(10 ng/mL)를 공시험용액으로 회수율을 확인하 였고, 표준용액을 첨가하였을 때 최종농도가 20, 40, 60 μg/ mL이 되도록 설정하여 진행하였다. 시료에 존재하는 참값 과 가까운 농도를 시료에 추가하여 회수율을 측정하였다. 검출한계와 정량한계의 경우 표준용액을 3회 분석한 검량 선의 기울기와 y절편 값을 이용하여, 검량선 y절편 값의 표준편차에 3.3배를 곱한 값을 기울기 평균값으로 나눈 것 을 검출한계, 10배를 곱한 값에 기울기 평균값으로 나눈 것을 정량한계로 설정하였다. 정밀도는 시료량의 변화에 대한 반복 정밀도(반복성, repeatability)를 확인하기 위하 여 1개의 표본시료를 선정하였으며, 시료 100 mg, 150 mg, 200 mg을 취하여 5회 반복 측정하였다. 마지막으로 실험 실간 정밀도(reproducibility)를 확인하기 위하여 3개 실험 실에서 표본시료를 5회 반복 측정하였다.

    기기조건

    4-Hydroxy-L-isoleucine을 분석하기 위해 Photo diode array detector (PDA) (Accela PDA 80, Thermo Fisher Scientific Co., Waltham, MA, USA)가 장착된 Highperformance liquid chromatography (HPLC) (Nanospace SI-2, Shiseido Co., Osaka, Japan)를 사용하였으며 컬럼은 Capcell Pack C18 UG120 (4.6 × 250 mm, 5 μm) (Shiseido Co., Osaka, Japan)이었고, 이동상으로는 Table 1과 같이 20 mM 인산수소이나트륨(pH 7.8, 20 mM 인산이수소나트륨으 로 조정)과 90% 아세토니트릴을 85:15 비율로 혼합하여 0.7 mL/min 유속으로 측정파장은 338 nm로 하여 분석하 였다.

    Results and Discussion

    최적분석조건 확립

    건강기능식품공전시험법의 폴리감마글루탐산 제2법에서 이동상 용매를 20 mM 인산수소이나트륨과 90% 아세토니 트릴 비율 82:18로 사용하였으나 피크 분리도를 높이기 위 해 이동상 비율을 85:15, 90:10 으로 달리하여 표준용액과 시험용액의 피크 분리도를 비교하였다. 그 결과 이동상 비 율 85:15로 분석하였을 때 상대적으로 가장 분리도가 높 았으며 머무름시간 8.9분으로 상대적으로 적절하여 이동 상 비율 85:15로 기기조건을 선택하였다(Fig. 1).

    건강기능식품공전시험법의 폴리감마글루탐산 제2법 시 험법과 개별인정형 기능성 원료 시험법을 참고하여 0.02 N 염산과 증류수로 전처리조건을 달리하여 분석함량을 비교 하였다. 그 결과 표준품 및 시료의 피크면적값과 머무름 시간에 큰 차이가 없어 추출용매를 보다 간편한 시험법인 증류수로 선택하였다(Table 2).

    건강기능식품공전시험법의 폴리감마글루탐산 제2법과 개 별인정형 기능성 원료 시험법에서 시료량은 각 1-2 g과 1 g으로 희석과정이 많은 단점을 보완하기 위해 희석과정이 필요하지 않은 300 mg 미만으로 시료량을 설정하였다. 단, 건강기능식품의 경우 기능성 원료뿐만 아니라 다양한 원 료가 복합된 제품으로도 제조되기 때문에 시료량의 설정 시 지표성분을 기준으로 설정하는 것이 적절하다. 이에 시 료량 최소 100 mg에서 최대 200 mg 칭량함을 기준으로 하여 4-hydroxy-L-isoleucine으로서 최소 1.5 mg 최대 3 mg 인 100, 150, 200 mg으로 시료량 설정을 검토하였다. 분 석 결과 표시량 대비 회수율이 90% 이상으로 시료 채취 량을 4-hydroxy-L-isoleucine으로서 1.5-3 mg으로 선정하였 다(Table 3).

    밸리데이션 및 적용성

    특이성

    특이성을 확인하기 위하여 표준품과 시료에서의 분리도 및 머무름 시간을 확인하였다. Fig. 2는 표준용액과 시험 용액을 분석한 크로마토그램이며 동일한 위치에서 단일 피크가 형성되는지 확인하였다. 그 결과 표준용액과 시험 용액에서 4-hydroxy-L-isoleucine의 머무름 시간 8.9분으로 일치함을 확인할 수 있었고 분리된 피크의 정점에서 PDA 스펙트럼 패턴이 표준용액과 시험용액에서 일치함을 확인 할 수 있었다.

    직선성

    시료에서 4-hydroxy-L-isoleucine 성분이 검출되는 농도 범위를 중간값으로 설정하여 총 7개의 농도 5, 10, 20, 40, 60, 80, 100 μg/mL를 검토하였다. 시험 시 나타날 수 있는 오차범위를 확인하기 위하여 각 농도에 대해서 3반복 실 험을 수행하였다. 실험 결과 검량선의 상관계수(R2)는 0.999 이상이었다(Fig. 3).

    검출한계(LOD) 및 정량한계(LOQ)

    표준용액을 3회 분석한 검량선의 기울기와 y절편 값을 이용하여, 검량선 y절편 값의 표준편차에 3.3배를 곱한 값 을 기울기 평균값으로 나눈 것을 검출한계, 10배를 곱한 값에 기울기 평균값으로 나눈 것을 정량한계로 설정하였 다. 4-hydroxy-L-isoleucine의 검출한계는 1.2 μg/mL이며, 정량한계는 3.6 μg/mL로 나타났다.

    정확도

    표준물질 첨가법을 이용하여 비타민 C(10 ng/mL)를 공 시험용액으로하여 회수율을 확인하였고, 표준용액을 첨가 하였을 때 최종농도가 20, 40, 60 μg/mL이 되도록 설정하 여 진행하였다. 시료에 존재하는 참값과 가까운 농도를 시 료에 추가하여 회수율을 측정하였다. 그 결과 4-hydroxy-L-isoleucine에 대한 회수율은 91.7-96.4%로 나타났으며 상 대표준편차는 0.2-2.4%로 나타났다(Table 4).

    정밀도

    시료량의 변화에 대한 반복 정밀도(반복성, repeatability) 를 확인하기 위하여 1개의 표본시료를 선정하였으며, 시 료 100 mg, 150 mg, 200 mg을 취하여 5회 반복 측정하였 다. 각 농도의 상대표준편차(%RSD)를 확인한 결과 1.1, 0.6, 0.5%로 나타났다(Table 5).

    실험실간 정밀도(reproducibility)를 확인하기 위하여 1개 의 표본시료를 선정하여 세 실험실에서 각각 5회 반복 측 정했다. 4-hydroxy-L-isoleucine에 대한 재현성의 상대표준 편차를 확인한 결과 0.5%로 나타났다(Table 6).

    적용성

    수거한 건강기능식품에 대하여 확립된 4-hydroxy-L-isoleucine 시험법을 이용하여 지표성분의 함유량에 대해 적용성 검토를 수행하였다. 그 결과 총 3건의 유통제품에 서 각각 13.4, 17.4, 25.5 mg/g으로 분석되었고 표시 함량 대비 91-103%로 기준규격에 적합함을 확인하였다(Table 7).

    국문요약

    본 연구는 건강기능식품 호로파종자식이섬유 중 4-hydroxy-L-isoleucine에 대한 분석법을 개발하는 연구이다. 최적분석 조건을 확립하기 위해 시료 채취량, 전처리 용매 및 이동 상 용매 조건을 비교 검토하였으며, HPLC-PDA를 이용하 여 시료 중의 4-hydroxy-L-isoleucine를 분석하였다. 분석 시 사용한 컬럼은 Capcell Pack UG120 C18 (Shiseido, 4.6×250 mm, 5 μm)이며, 유도체 시약으로 OPA를 선정하 였다. 확립된 시험법에 대해 특이성, 직선성, 검출한계, 정 량한계, 정확성, 정밀성 등의 밸리데이션을 수행하였다. 5- 100 μg/mL 농도에서 결정계수(R2) 0.999 이상으로 높은 직 선성을 확인하였다. 또한, 회수율은 91.7-96.4%이었고, 정 밀성은 0.5-1.1%의 상대표준편차(%RSD)를 확인하였다. 개 발된 시험법은 호로파종자추출물 중 4-hydroxy-L-isoleucine 분석을 위한 시험법으로 활용되기에 적합한 것으로 판단된다.

    Acknowledgement

    본 연구는 2019년도 식품의약품안전처 연구개발사업의 연구비지원(19161미래안054)에 의해 수행되었으며 이에 감 사드립니다.최근 소비자 요구에 따라 다양한 기능성이 포함될 수 있도록 여러 가지 건강기능식품 기능성 원료가 혼합되어 제조되는 경우가 많아지고 있으며, 동일한 지표성분을 가 지고 있는 기능성 원료 혹은 동일한 성분을 가지고 있는 기타원료가 혼합되어 제조될 수 있는 가능성도 높아졌다. 이에 효율적이고 신뢰성 있는 사후관리 등 기준·규격 관 리를 위해 고시형 건강기능식품(68종)의 지표성분에 대한 적합성 검토를 실시하였고, 2018년 연구사업을 통해 호로 파종자식이섬유가 그 중 하나로 설정되었다.

    Figure

    JFHS-35-3-213_F1.gif

    HPLC chromatogram of (A) standard 100 μg/mL at rate 82:18, (B) sample at rate 82:18, (C) standard 100 μg/mL at rate 85:15, (D) sample at rate 85:15, (E) standard 100 μg/mL at rate 90:10 and (F) sample at rate 90:10.

    JFHS-35-3-213_F2.gif

    HPLC chromatogram and spectrum of 4-hydroxy-L-isoleucine in (A) standard and (B) sample.

    JFHS-35-3-213_F3.gif

    Calibration curves of 4-hydroxy-L-isoleucine.

    Table

    Analytical parameters of LC-PDA for 4-hydroxy-L-isoleucine in sample

    Comparison of analysis results by extraction solvent

    Comparison of analysis results by sample amounts (Based on total 4-hydroxy-L-isoleucine contents)

    Accuracy of analytical method for 4-hydroxy-L-isoleucine (n=5)

    Repeatability of analytical method for 4-hydroxy-L-isoleucine in sample (n=5)

    Inter-laboratory reproducibility for the determination of 4-hydroxy-L-isoleucine in sample (n=5)

    Results of application of health functional foods in circulation about analytical method

    Reference

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