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ISSN : 1229-1153(Print)
ISSN : 2465-9223(Online)
Journal of Food Hygiene and Safety Vol.35 No.4 pp.334-340
DOI : https://doi.org/10.13103/JFHS.2020.35.4.334

Improvement of the Detection Technique of Listeria monocytogenes through Modification of the Enrichment Medium and DNA Extraction Buffer

Jeeyeon Lee1, Yeongeun Seo2, Yohan Yoon2,3*
1Department of Food & Nutrition, Dong-eui University, Busan, Korea
2Department of Food and Nutrition, Sookmyung Women’s University, Seoul, Korea
3Risk Analysis Research Center, Sookmyung Women’s University, Seoul, Korea
*Correspondence to: Yohan Yoon, Department of Food and Nutrition, Sookmyung Women’s University, Seoul 04310, Korea Tel: +82-2-2077-7585, Fax: +82-2-710-9479 E-mail: yyoon@sookmyung.ac.kr
August 11, 2020 August 17, 2020 August 18, 2020

Abstract


In this study we developed an enrichment medium and lysis buffers to detect Listeria monocytogenes in meat and processed meat products under various lysis conditions. The enrichment efficiency of L. monocytogenes medium listed in the Food Standards was compared, and thus, Listeria Enrichment Broth (LEB) was modified by adding supplements such as carbon source and minerals. The lysis buffers were developed to extract L. monocytogenes DNA quickly and efficiently under various lysis conditions. L. monocytogenes was most rapidly grown in LEB containing 0.1% pyruvate and 0.1% ferric citrate. A lysis buffer mixed with 0.5% or 1% N-lauroylasrcosine sodium salt, 0.5 N NaOH and 0.5 M EDTA for 30 min at room temperature was found to be the best in terms of DNA purity and yield. These results indicate that developed enrichment medium and lysis buffer can be used to detect L. monocytogenes in meat and processed meat products rapidly and efficiently.



증균배지 및 DNA 추출법 개량을 통한 Listeria monocytogenes의 검출기법 개선 연구

이 지연1, 서 영은2, 윤 요한2,3*
1동의대학교 식품영양학과
2숙명여자대학교 식품영양학과
3숙명여자대학교 위해분석연구센터

초록


    Ministry of Agriculture, Food and Rural Affairs
    118104-2

    Listeria monocytogenes는 치사율이 20-30%로 매우 높은 그람양성의 식중독 세균으로 식육 및 식육가공품, 치즈, 아이스크림 등을 포함한 다양한 축산식품에서 검출되는 세균이다1-5). L. monocytogenes는 저온에서도 증식 가능한 저 온성 세균이기 때문에, cold chain을 통해 식육 및 식육가공 품이 유통될 때 L. monocytogenes가 증식할 수 있다6,7). 이 미 유통된 식품에서 L. monocytogenes가 검출될 경우 리 콜(recall)을 해야하는데 리콜에 따른 경제적 손실이 발생 할 수 있으며, 이미 유통된 식품을 섭취함으로써 식중독 발생 가능성이 존재할 수 있다8). 따라서 식육 및 식육가 공품이 유통되기 전 제품 내에서 L. monocytogenes의 존 재유무를 빠르게 파악하여 제품의 유통차단을 통한 유통 비용의 절감, 노동력 낭비 등을 막고, 국민 건강을 보호해 야 한다.

    우리나라 식품공전에 따르면 증균배양, 분리배양 및 확인 시험의 단계를 통해 L. monocytogenes를 검출하고 있다9). L. monocytogenes를 검출하고자 하는 시료의 종류마다 증균 배양 시 사용되는 배지의 종류가 약간 다른데, 식육 및 식 육가공품은 Listeria Enrichment Broth, PALCAM Broth, UVM Modified Listeria Enrichment Broth를 일차적으로 사 용하여 L. monocytogenes를 증균하고 있다. 식품공전에 따 르면 식육 및 식육가공품에서 L. monocytogenes를 증균하 는데 소요되는 절대적인 시간은 최소 46시간인 것으로 확 인되었다. 확인시험에서는 β-hemolysin을 나타내고 catalase 및 motility 양성, CAMP test 결과에서 Staphylococcus aureus ATCC25923 양성이며 Phodococcus equi ATCC6939 에서 음성, mannitol과 xylose는 비분해하며, rhamnose는 분해하는 경우 L. monocytogenes 양성으로 보고 있다. 이 러한 생화학적 시험법으로 L. monocytogenes를 확인할 경우 하루 이상의 시간이 소요된다. 증균배양과 확인시험만으로 최소 3일 이상의 시간이 필요한데9,10), L. monocytogenes의 오염 여부를 확인할 때까지 제품의 유통을 보류한다면 상 업적인 관점에서 3일은 판매 제품의 품질을 저하시킬 뿐 만 아니라 시험 완료시까지의 저장고 공간 확보의 어려움, 유통 지연으로 인한 경제적 이익 감소 등의 문제가 발생 할 가능성이 높다. 따라서 증균배양 시간을 줄이고, 적은 시간이 소요되는 빠른 확인시험법이 필요한데, 그것의 대 안으로 증균배지의 개량과 conventional polymerase chain reaction (PCR)을 활용한 확인시험이 있다11,12). 증균배지는 일반적인 배지보다 특정 세균, 본 연구에서는 L. monocytogenes의 증식을 용이하게 하고, 다른 세균들의 성 장을 억제시키기 위해 다양한 성분들을 일정 비율로 첨가 한 것인데13), 이러한 효과를 보완할 수 있는 성분들을 추 가해준다면 동일한 시간 내에 L. monocytogenes의 증식 효 율을 높일 수 있을 것으로 기대된다. Conventional PCR의 경우 DNA 추출과 유전자 증폭 및 전기영동 등의 과정을 거치는데, 대략 2-4시간 정도가 소요되는 기법이다. 그러 나 현재 시중에 유통되고 있는 DNA 추출 관련 kit들은 비전문가가 사용하기에 어려워 산업 현장에 적용하기에 부적절하며, 비싼 가격 등의 단점이 있다.

    따라서 본 연구에서는 증균배지를 개발하여 L. monocytogenes 의 증균 효율을 높이며, 현장에서의 사용 용이성이 있고 저렴한 DNA 추출과 관련된 각종 buffer 및 이에 맞는 세 포 용해 조건을 개발함으로써 L. monocytogenes의 검출기 법을 개선하고자 하였다.

    Materials and Methods

    L. monocytogenes 균액 준비

    3개의 L. monocytogenes 균주(L. monocytogenes ATCC13932, ATCC51174, ATCC BAA-839)의 단일집락을 10 mL의 tryptic soy broth에 0.6% yeast extract이 첨가된 배지 (TSBYE; Becton, Dickinson and Company, Sparks, MD, USA)에 접종하여 30°C에서 24시간 배양하였다. 배양액 중 0.1 mL을 취하여 새로운 10 mL의 TSBYE에 접종하여 30°C 에서 24시간 배양하였다. 배양액을 모두 동량으로 혼합하 여 원심분리(1,912×g, 15분, 4°C)하고, 상층액을 버린 뒤 30 mL의 phosphate buffered saline (PBS)을 가하여 균체를 현탁시켜 세척하였다. 동일 조건에서 한 번 더 원심분리 한 후 상층액을 버리고 30 mL PBS로 재현탁시켜 균액을 준비하였다.

    증균배지 별 L. monocytogenes 증균 효율 확인

    식품공전에 등재되어 있는 L. monocytogenes 증균배지 3종(Listeria Enrichment Broth (LEB; Becton, Dickinson and Company), UVM-modified Listeria Enrichment Broth (UVM-LEB; Becton, Dickinson and Company), PALCAM Broth (PB; MB cell; Log Angeles, CA, USA))을 배지 제 조법에 따라 제조하였다. L. monocytogenes 현탁액을 9 mL 의 PBS로 십진희석하여 3-4 Log CFU/mL의 접종액을 준 비하였다. 각 증균배지 10 mL에 L. monocytogenes를 0.1 mL씩 접종하여 30°C에서 배양하였다. 배양액을 0, 3, 6, 9, 12시간마다 tryptic soy agar에 0.6% yeast extract를 첨가한 배지(TSAYE; Becton, Dickinson and Company)에 평판도말한 뒤 30°C에서 24시간 배양하였다. 배양 후 집 락을 계수하고 증균배지에 따른 시간 별 L. monocytogenes 증균 속도를 통해 증균배지 별 증균 효율을 확인하였다. 이를 3회 반복하여 실험하였다.

    증균배지 개발을 통한 L. monocytogenes 증균 효율 향 상 비교

    증균배지 3종 중 증균 효율이 뛰어나고 사용빈도가 높 은 증균배지(LEB)를 선택하여 배지의 성분을 개량함으로 써 증균배지를 개발하였다. 증균배지 개발에 사용된 성분 은 탄소원으로써 pyruvate, 질소원으로써 cysteine, 미량 무 기질로써 ferric citrate, iron chloride (FeCl2), thiamine hydrochloride, buffer로써 3-morpholinopropane-1-sulfonic acid (MOPS), 항생제로써 polymyxin B가 일정 농도로 사 용되었다(Table 1). L. monocytogenes 현탁액을 9 mL의 PBS로 십진희석하여 3-4 Log CFU/mL의 접종액을 준비 하였다. 일정 농도의 성분을 첨가한 각각의 증균배지 10 mL 과 일반 증균배지(LEB; control) 10 mL에 0.1 mL의 L. monocytogenes를 접종하여 30°C에서 배양하였다. 12시간 뒤 배양액을 꺼내어 0.1% buffered peptone water (Becton, Dickinson and Company)로 적절히 십진희석하고 TSAYE 에 평판도말 하였다. 평판도말한 배지를 30°C에서 24시 간 동안 배양한 후 집락을 계수하고, 개발 증균배지와 LEB의 증균 효율을 비교하였다. 이를 3회 반복하여 실험 하였다.

    DNA 용해 버퍼 및 용해조건에 따른 DNA 추출 효율성 확인

    DNA의 추출 과정에서 필요한 버퍼는 용해버퍼(lysis buffer), 세척버퍼(washing buffer), 용출버퍼(elution buffer)로 대표된다. 용해버퍼는 sodium dodecyl salt (SDS), ethylenediamine-N, N, N’, N’-tetraaectic acid (EDTA), Nlauroylsarcosine sodium salt (NLS sodium salt), NaOH를 적절한 농도로 단일 또는 혼합하여 제조 및 사용하였고 (Table 2), 세척버퍼는 20 mM NaCl, 2 mM Tris-HCl (pH 7.5), 80% ethanol을 혼합하여 사용하였다. 용출버퍼는 DNase free water를 사용하였다. L. monocytogenes 현탁액 을 원심분리(1,912×g, 15분, 4°C)하고 상층액을 제거하였 다. 균체를 용해시키기 위해 다양하게 제조된 용해버퍼를 1 mL 가한 뒤 강하게 현탁시키고 새로운 e-tube에 옮겨 담았다. 용해조건은 총 세 가지로, 99°C에서 15분, 99°C에 서 30분, 실온에서 30분으로 하여 용해버퍼에 담긴 균체 를 용해시켰다. Column (Hyundai micro Co., LTD, Seoul, Korea)에 용해액을 넣고 원심분리(8,000×g, 1분, 4°C)하고 하단의 용액(flow-through)를 버렸다. Column에 0.6 mL의 세척버퍼를 가한 뒤 동일 조건으로 원심분리(8,000 ×g, 1- 2분, 4°C)하고 flow-through를 버렸다(2회 반복). 새로운 etube에 column을 끼워 넣고 0.2 mL의 용출버퍼를 가한 뒤 실온에 1분간 방치하였다가 원심분리(8,000 ×g, 2분, 4°C) 하여 DNA를 추출하였다. 추출된 DNA의 순도(260/280 ratio)와 수율(ng/μL)은 Take 3 (BioTeck Instruments Inc., Winooski, VT, USA)를 이용하여 측정하였다. 추출된 DNA 의 순도와 수율이 적합한지 확인하기 위해서 상용화된 DNA 분리 및 정제 키트 2종(KIT1, KIT2)을 이용하여 추 출된 DNA의 순도 및 수율과 비교하였다. 이를 3회 반복 하여 실험하였다.

    Results and Discussion

    개발 증균배지 별 L. monocytogenes의 증균 효율

    중균배지 별 L. monocytogenes 증균 효율을 살펴보았을 때, 증균 효율은 LEB와 UVM-LEB에서 비슷하게 나타났 다. PB는 증균 효율이 매우 낮은 것으로 확인되었다(data not shown). 따라서 증균배지 3종 중 증균 효율이 뛰어나 고 사용빈도 높은 LEB를 성분개량 증균배지로 선정하였다.

    LEB에 성분과 농도를 달리 첨가하여 개발 증균배지를 제조하였다. 단일성분을 첨가한 개발 증균배지 15종과 혼 합성분을 첨가한 개발 증균배지 5종을 제조하여 개발 증 균배지 별 L. monocytogenes의 증균 효율을 분석하였다. 단일성분을 첨가한 개발 증균배지의 L. monocytogenes 증 균 효율 분석 결과, 0.1% pyruvate 또는 0.1% ferric citrate 를 첨가하였을 때 control 대비 0.6 Log CFU/mL 더 증균되 었다. 또한 0.2% pyruvate 또는 0.001% thiamine hydrochloride 를 첨가했을 때는 control 대비 0.3 Log CFU/mL 더 증균되 었다. 반면 polymyxin B가 100 IU/mL, 1,000 IU/mL 첨가된 증 균배지에서는 L. monocytogenes가 control 대비 0.5 Log CFU/mL, 1.7 Log CFU/mL 감소된 것을 확인하였다(Table 3). 단일성분 중에서 L. monocytogenes의 증균 효율을 높 인 성분(pyruvate, iron chloride, ferric citrate, thiamine hydrochloride)을 혼합하여 5종의 개발 증균배지를 제조하 고, 개발 증균배지 별 L. monocytogenes의 증균 효율을 분 석하였다. 그 결과, 0.1% pyruvate과 0.1% ferric citrate를 혼합하여 첨가하였을 때 가장 증균 효율이 우수하였으며, control 대비 0.8 Log CFU/mL 더 증균되었음을 확인하였 다. 0.1% pyruvate과 0.05% ferric citrate를 혼합하여 첨가 하였을 때에는 단일성분 첨가 시와 차이가 없었다(0.6 Log CFU/mL 증가) (Table 4). 일반적으로 L. monocytogenes는 철을 이용하는 성질을 가지고 있어 철이 함유된 배지에서 증식 및 생존이 용이하다10,14).

    본 실험에는 순수배양한 L. monocytogenes가 이용되었 는데, 식육 및 식육가공품에는 다양한 background flora가 존재할 수 있으며, 이들은 L. monocytogenes의 성장 및 증 식에 영향을 미칠 수 있다. 따라서 본 연구결과를 활용하 여 background flora는 억제시키고 L. monocytogenes만을 선택적으로 증균시킬 수 있는 증균배지 개발을 위한 추가 실험이 필요할 것으로 사료된다.

    용해버퍼 조성 및 용해조건에 따른 DNA 추출 효율

    추출된 DNA의 순도는 1.8±0.2가 적당한 것으로 판단한 다15,16). 용해버퍼의 조성 및 용해조건에 따라 L. monocytogenes 의 DNA를 추출한 결과, 0.5% NLS sodium salt에 0.5 N NaOH, 0.5 M EDTA를 이용하여 99°C에서 30분, 실온에 서 30분 간 용해시킨 후 DNA를 처리하였을 때 DNA의 순도가 각각 2.00, 1.89로 나타나 순도가 높은 것을 확인 하였다(Table 5). 또한 1% NLS sodium salt + 0.5 N NaOH + 0.5 M EDTA를 이용하여 실온에서 30분 간 용해시켰을 때에는 DNA 순도가 1.96으로 나타났다. KIT1로 추출한 DNA의 순도는 2.02, KIT2로 추출한 DNA의 순도는 1.93 으로, 본 연구에서 개발된 용해버퍼 및 용해조건과 유사 하게 나타난 것을 확인하였다.

    DNA의 수율은 0.1-1 ng/μL이면 conventional PCR을 수 행하기에 충분하다고 본다17,18). DNA의 수율은 1 M EDTA 를 이용해서 99°C에서 15분, 실온에서 30분 간 용해시켰 을 때 각각 109.21 ng/μL, 160.73 ng/μL로 우수하게 나타 났다. 또한 1% NLS sodium salt + 0.5 N NaOH를 이용 해서 99°C에서 30분 간 용해시켰을 때 110.17 ng/μL로 나 타났다(Table 5). KIT1로 추출한 DNA의 농도는 139.82 ng/ μL, KIT2로 추출한 DNA의 농도는 148.11 ng/μL로 본 연 구에서 개발된 용해버퍼 및 용해조건보다는 유사하거나 높은 수율의 DNA를 추출한 것으로 확인되었다.

    상용화된 kit 두 가지(KIT1, KIT2)를 이용하여 DNA를 추출할 경우와 비교하여 본 연구에서 개발된 용해버퍼 및 용해조건을 이용하여 DNA를 추출할 경우 발생하는 이점 은 크게 두 가지가 있다. 첫 번째, DNA 추출에 소요되는 비용이 매우 저렴하다. 한 시료의 DNA를 추출할 때 대략 적인 가격을 살펴보면, 본 연구의 방법을 이용할 경우 KIT1과 KIT2보다 1/3 이상 저렴한 가격으로 DNA를 추 출할 수 있다. 두 번째, DNA 추출에 소요되는 시간이 짧 다. 본 연구의 방법을 이용할 경우 1시간 내로 DNA 추출 이 가능하나, KIT1과 KIT2를 이용할 경우 최소 80분, 최 대 160분의 시간이 소요된다.

    최종적으로 DNA의 순도와 현장 적용 가능성, DNA 추 출 방법의 신규성과 경제적 측면을 고려하여 용해버퍼 및 용해조건을 선정하였다. 그 결과, 0.5% NLS sodium salt + 0.5 N NaOH + 0.5 M EDTA 또는 1% NLS sodium salt + 0.5 N NaOH + 0.5 M EDTA를 용해버퍼로 이용하여 실온에서 30분 간 용해시키는 것이 DNA를 순도 높게 적 절한 수율로 추출해내는 것으로 나타나 이를 DNA 추출 방법으로 선정하였다.

    Conclusion

    결론적으로 LEB에 0.1% pyruvate과 0.1% ferric citrate 를 첨가한 증균배지가 기존 LEB에 비하여 동일 시간 내 에(12시간) L. monocytogenes를 더 증균시켜 증균 효율을 높이는 것으로 확인되었다. 또한 L. monocytogenes의 DNA 추출 시 개발된 용해버퍼 및 용해조건을 활용한다면 순도 높고 적절한 수율의 DNA를 단 시간에 저렴한 가격으로 추출해낼 수 있다. 따라서 본 연구에서 개발된 증균배지 와 DNA 추출법을 결합한다면, 식육 및 식육가공품에 오 염된 L. monocytogenes를 식품공전법을 사용하였을 때 보 다 신속하게 검출할 수 있을 것으로 사료된다.

    국문요약

    기존의 L. monocytogenes 증균배지를 개량함으로써 증 균배지를 개발하여 L. monocytogenes의 증균 효율을 높이 며, DNA 추출에 사용되는 용해버퍼 및 용해조건을 개발 함으로써 식육 및 식육가공품에서 L. monocytogenes를 효 율적이고 신속하게 검출하고자 하였다. 식품공전에 등재 되어 있는 L. monocytogenes 증균배지의 증균 효율을 비 교하였으며, Listeria Enrichment Broth (LEB)가 가장 우수 한 증균 효율을 보였다. LEB에 탄소원, 질소원, 미네랄 등 다양한 성분을 첨가하여 증균배지를 개발하였으며, 그 결 과 LEB에 0.1% pyruvate, 0.1% ferric citrate를 첨가한 개 발 증균배지에서 L. monocytogenes가 가장 빠르게 증균되 었다. L. monocytogenes의 DNA를 신속하고 효율적으로 추출하기 위해 용해버퍼와 용해조건을 개발하였으며, 그 결 과 0.5% 또는 1% N-lauroylsarcosine sodium salt에 0.5 N NaOH와 0.5 M EDTA가 혼합된 용해버퍼를 이용하여 실 온에서 30분 간 L. monocytogenes 세포를 용해시키는 것 이 DNA의 순도와 수율, 신규성과 경제적 측면에서 가장 우수한 것으로 확인되었다. 결론적으로 본 연구에서 개발 된 증균배지 및 DNA 추출법을 활용한다면 식육 및 식육 가공품에서 L. monocytogenes를 보다 신속하게 검출할 수 있을 것이다.

    Acknowledgement

    본 결과물은 농림축산식품부의 재원으로 농림식품기술 기획평가원의 농축산물 안전생산·유통관리기술개발사업의 지원을 받아 연구되었음(118104-2).

    Figure

    Table

    Supplements and concentrations added to L. monocytogenes enrichment medium

    Ingredients and concentrations of ingredients in lysis buffer

    Enrichment efficiency of enrichment medium with added single ingredient

    Data are presented as mean±standard error.

    Enrichment efficiency of enrichment medium with added mixed components

    Data are presented as mean±standard error.

    DNA extraction efficiency according to lysis buffer composition and lysis condition

    Data are presented as mean±standard deviation.
    1)Room temperature.

    Reference

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