산업화된 국가에서 아토피 환자는 지속적으로 증가하는 추세로 국내에서는 유채원생의 34%, 초등학생의 25% 정 도가 아토피 피부염의 증세를 보이고 있다1). 이러한 아토 피성 피부염의 증상은 염증성 피부질환으로 특정 알레르 겐에 대한 알레르기 반응이 특징적이다2). 그러나, 이와 같 은 만성적인 피부질환의 치료 목적으로 스테로이드와 같 은 약물의 사용함으로 인해 많은 부작용이 나타나고 있어 피부질환 증상완화 목적의 치료제로 유효성과 안정성이 확보된 지속적인 사용이 가능한 제품의 개발이 절실한 상 황이다3). 이에 따라, 피부개선에 사용될 수 있는 한방 천 연소재를 이용한 많은 연구가 시도되고 있다. 그러므로 본 연구에서는 염증성 피부질환에 효능이 있는 것으로 알려 진 한방 천연소재 중 황백(Phellodendri cortex)에 대하여 연구를 진행하였다.
황백은 운향과(rutaceae) 식물인 황벽나무(Phellodendron amurense Ruprecht)의 껍질을 벗겨내 말린 줄기껍질이다4). 황백은 신라시대부터 사용된 전통 한약재로 해독, 해열, 황달, 설사, 염증, 폐렴, 감기 등에 유용한 생약으로 폭넓 게 사용되고 있다5). 황백의 항균작용, 항바이러스작용, 항 염증작용, 항고지혈작용 등의 약리활성 및 다양한 기능성 은 isoquinoline alkaloid의 protoberberine class인 berberine, palmatine 등의 alkaloids에 의한 것으로 알려져 있다6-8). 황 백의 가장 대표적인 지표물질인 berberine은 황백 내에 0.6~2.5% 정도가 함유되어 있는 것으로 알려져 있으며, 항 염증, 전염증성 cytokine 생성 억제, 항균작용, 암세포 생 장 억제 등의 연구가 진행된 바가 있다9-13). 또 다른 지표 물질인 palmatine은 멜라닌 생합성 억제, 모노아민 산화효 소 저해활성, 고혈당 저해 등이 보고되었다14,15). 이와 같이 berberine과 palmatine에 관한 약리학적 효능 및 생리활성 연구에 관한 연구가 꾸준히 진행된 바가 있으나, 항산화 활성에 관한 연구는 비교적 많이 진행되지 않았고 이를 적용한 연구도 부족한 실정이다. 또한 최근 한방 소재에 대한 관심과 수요가 증가함에 따라 한방 소재의 보다 체 계적이고 효율적인 품질 관리법의 확립이 요구되고 있다16).
황백에서 berberine을 정량 분석하기 위한 고속액체크로마 토그래프(High performance liquid chromatograph, HPLC) 분 석방법은 보고된 바 있으나 다른 alkaloid 성분들과의 동 시분석방법은 부족한 실정으로 이는 구성 성분들 간의 시 너지 효과 및 복잡성을 밝히기에 불충분하며 편향된 평가 로 이어질 수 있다17).
따라서 본 연구에서는 황백의 대표적인 지표물질인 berberine과 palmatine의 동시분석법의 개발 및 검증을 진 행하고 항산화 활성에 대해 연구하였다.
Materials and Methods
실험재료
본 실험에서 사용된 황백 추출물은 콤비메드(Yanggu, Korea)에서 제공받아 사용하였다. Berberine, phosphoric acid, potassium ferricyanide, trichloroacetic acid, Iron(III) chloride, sodium acetate, sodium phosphate, TPTZ (2,4,6- tripyridyl-s-triazine), ferric chloride, acetic acid, griess reagent 등은 Sigma (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MI, USA)로부터 구입하여 사용했으며, palmatine은 PhytoLab (PhytoLab GmbH & Co., Vestenbergsgreuth, Germany)로 부터 구입하여 사용하였다. 용매로 사용한 acetonitrile은 J.T. Baker (J.T.Baker Chemicals Co., Phillipsburg, NJ, USA)로부터 구입하여 사용하였다.
Berberine 및 palmatine 분석
Berberin과 palmatine의 HPLC 분석은 Li 등17)의 분석방 법을 변형하여 실시했으며, 두 개의 표준물질을 동시 분 석하였다. 분석에 사용한 기기는 Waters 2695 Separation Module HPLC system과 Waters 996 Photodiode Array Detector (Waters, Milford, MA, USA)로 분석조건은 Table 1과 같으며 분석용 column은 Intersil ODS-3 C18 (4.6 mm × 250 mm, 5.0 μm, Intersil, Milpitas, CA, USA)이었다.
표준용액 조제
Berberine 및 palmatine 표준물질을 각각 10 mg 취한 뒤, 10 mL 정용플라스크를 이용해 1,000 μg/mL의 농도가 되 도록 증류수로 표선까지 정용하여 이를 stock solution으로 하였다. Working solution은 제조된 berberine 및 palmatine stock solution을 각각 5 mL씩 섞어 500 μg/mL의 standard mixture를 제조하고 이를 증류수로 희석하여 3.13, 6.25, 12.5, 25, 50, 100, 200 μg/mL이 되도록 하였다.
분석법의 유효성 검증
분석법의 유효성 검증(method validation)은 ICH (International Conference for Harmonization) 가이드라인18) 을 근거로 하여 개발된 분석법의 특이성(specificity), 직선성 (linearity), 정밀성(precision), 정확성(accuracy), 검출한계(limit of detection, LOD) 및 정량한계(limit of quantification, LOQ) 를 이용하여 분석법의 유효성을 검증하였다.
특이성
표준물질 berberine, palmatine을 HPLC로 분석하여 얻은 chromatogram을 비교하여 berberine과 palmatine이 선택적으로 분리가 되는지 확인했으며 photodiode-array (PDA) spectrum 을 확인하여 동일한 spectrum을 나타내는지 확인하였다.
직선성
Berberine 및 palmatine 표준물질을 3.13, 6.25, 12.5, 25, 50, 100, 200 μg/mL의 농도로 제조해 HPLC를 이용하여 3 회 반복 측정했으며, 각 표준물질의 peak에 대한 면적과 농도비의 관계를 표시하는 검량선을 작성하고 작성한 검 량선으로부터 얻어진 상관계수(correlation coefficient, R2) 값을 통해 직선성을 확인하였다.
정밀성 및 정확성
농도를 알고 있는 황백 추출물에 표준용액 berberine 및 palmatine을 12.5, 25, 50 μg/mL의 농도씩 각각 첨가해 일 내(Intra-day) 정밀성 및 정확성을 확인하기 위해 하루에 3 회 반복하여 HPLC로 분석하였으며, 일간(Inter-day) 정밀 성 및 정확성을 확인하기 위해 3일간 반복하여 HPLC로 분석하였다. 분석하여 얻어진 peak의 머무름 시간(retention time)과 PDA spectrum을 비교하여 정성을 하고 작성한 검 량선에 시험용액의 peak 면적을 대입하여 berberine과 palmatine의 농도를 계산하였다. 각 결과 값의 표준편차를 결과 값의 평균으로 나눈 비인 상대표준편차(relative standard deviation, RSD)로 일내 및 일간 정밀성을 확인했 으며, 정확성은 다음 식을 이용하여 첨가한 농도에 대비 하여 회수된 농도를 계산함으로서 회수율을 구해 정확성 을 확인하였다.
검출한계 및 정량한계
Berberine 및 palmatine의 검출한계(LOD) 및 정량한계 (LOQ)는 검량선의 기울기와 표준편차에 근거하는 방법을 사용했으며 다음 식을 이용하여 확인하였다.
FRAP 측정
Ferric ion reducing antioxidant power (FRAP) assay는 Kwon 등19)의 방법을 이용하여 측정하였다. FRAP assay는 ferric ion (Fe3+)가 ferrous (Fe2+)로 환원되어 TPTZ와 결합 하여 blue 계열의 색을 나타내어 환원력을 흡광도 값으로 나타내는 방법이다. Sodium acetate (C2H3NaO2)와 acetic acid(C2H4O2)를 혼합하여 sodium acetate buffer (pH 3.6)를 만들고, 40 mM HCl과 TPTZ (2,4,6-tripyridyl-s-triazine)를 혼합하여 10 mM TPTZ solution을 만든다. 실험을 위한 반 응용액은 sodium acetate buffer (pH 3.6), 10 mM TPTZ (2,4,6-tripyridyl-s- triazine) 및 20 mM FeCl3·6H2O를 10:1:1 비율로 혼합하여 만들어 사용하였다. 조제한 용액 1.5 mL 과 DW를 사용하여 농도별로 희석한 시료 50 μL, DW 150 μL를 혼합한 후 37°C에서 4분간 반응 시킨 후 593 nm 에서 흡광도를 측정하였다.
Reducing power activity 측정
Reducing power activity는 Sim 등20)의 방법을 이용하여 실험하였다. Reducing power activity는 ferric-ferricyanide (Fe3+) 혼합물이 수소를 공여하여 유리라디칼을 안정화시 켜 ferrous (Fe2+)로 전환하는 환원력을 흡광도의 값으로 나타내는 방법이다. 시료 0.5 mL, 0.2 M sodium phosphate buffer 2.5 mL, 1% potassium ferricyanide 2.5 mL를 혼합 하여 50°C에서 20분간 반응시켰다. 반응시킨 용액에 10% trichloroacetic acid 2.5 mL를 첨가한 뒤 12,000 rpm에서 10 분간 원심 분리한 후 상등액 2.5 mL에 3차 증류수 2.5 mL 과 0.1% iron (III) chloride 2.5 mL를 첨가하였다. 상온에 서 10분간 반응시켜 microplate reader를 이용하여 700 nm 에서 흡광도를 측정하였으며, 흡광도 값을 통해 reducing power를 비교하였다.
아질산염 소거능 측정
아질산염 소거능은 Sim 등20)의 방법을 이용하여 측정 하였다. 시료 0.5 mL에 1 mM NaNO2 용액 0.5 mL를 첨 가하고 0.1 N HCl로 반응용액의 pH를 1.2로 보정한 후 반응용액의 최종부피는 증류수를 첨가하여 5 mL로 하였 다. 그 후 37°C에서 1시간 동안 반응시킨 뒤 반응액을 1 mL씩 취하여 2% acetic acid 5 mL와 Griess reagent 0.4 mL를 혼합시킨 뒤 상온에서 15분간 반응시킨 후 microplate reader를 이용하여 520 nm에서 흡광도를 측정 하였다. 아질산염 소거능은 다음의 식을 이용하여 계산하 였다.
통계분석
FRAP assay, reducing power activity, 아질산염 소거능 측정은 SAS version 9.4 (SAS institute Inc., Cary, NC, USA)을 이용하여 분석하였다. 유의성 분석은 one-way ANOVA 검정을 실시하여 유의성은 P<0.05 수준에서 검 정하였다.
Results and Discussion
Berberine 및 palmatine의 크로마토그램
Berberine과 palmatine을 동시분석하기 위하여 기존의 분 석법17)을 참고하여 berberine 및 palmatine 표준물질들에 대한 최대흡수 파장을 검토한 결과, 각각 229.7, 265.0, 346.8 nm와 226.2, 274.4, 345.6 nm에서 최대흡수파장을 나 타냈다(Fig. 1). 각 물질의 최대흡수파장 및 기존 보고된 논문21)의 분석 파장인 230 nm에 따른 두 물질의 peak 면 적을 비교하여 최적 면적 값을 나타내는 파장 값을 확인 한 결과, 232 nm에서 두 물질의 최적 peak 면적 값을 나 타내 최적분석파장은 232 nm로 설정하였다.
특이성 및 직선성
특이성이란 추출물, 불순물 등이 혼합되어 있는 시료에 서 분석대상물질을 선택적으로 측정할 수 있는 능력을 말 한다. 표준용액과 혼합 추출물의 chromatogram을 비교하 여 berberine과 palmatine의 peak를 확인한 결과 Fig. 2와 같이 berberine과 palmatine이 간섭 없이 선택적으로 분리 되었음을 확인하였다. 각 지표물질의 표준용액과 지표물 질 혼합용액에서 머무름 시간이 일치하는 것을 확인하였 으며, PDA spectrum 결과에서도 동일한 spectrum을 나타 냈으며 이를 통해 특이성을 확인하였다(Fig. 1).
또한, berberine과 palmatine 표준용액을 3.13, 6.25, 12.5, 25, 50, 100, 200 μg/mL 농도로 단계적으로 희석하여 HPLC 로 분석한 결과, berberine 및 palmatine의 표준검량선은 각각 y=27256.6x–39147, y=41917.2x–76447로 나타났으며 상관계수(R2) 값은 두 가지 성분 모두 0.9999로 나타나 우 수한 직선성을 보였다(Fig. 3). 이 결과를 통해 berberine 의 머무름 시간은 Li 등17)의 연구와 비슷한 것을 확인할 수 있었고 직선성은 식품의약품안전평가원의 연구9) 결과 와 유사한 결과를 확인할 수 있었다(Fig. 3).
정밀성 및 정확성
농도를 알고 있는 황백 추출물에 표준용액을 각각 저농 도(12.5 μg/mL), 중농도(25 μg/mL), 고농도(50 μg/mL)로 첨가 한 뒤 HPLC로 분석했을 때, 각 측정 결과 값 사이의 근접 성을 확인하여 정밀성을 평가하며, 회수율을 측정하여 정확 성을 평가하였다. 정밀성의 결과는 상대표준편차(RSD)로 확 인했다. Berberine 및 palmatine의 정밀성은 일간 정밀성에서 각각 1.27-1.93%, 0.19-2.89%를 나타냈으며 일내 정밀성에서 는 0.12-0.56%, 0.36-1.52%로 5% 이하의 우수한 정밀성을 나타냈다. 정확성은 회수율을 측정하여 나타내며 berberine 및 palmatine의 일간 정확성은 98.43-100.73%, 93.20-100.60% 를 나타냈고 일내 정확성은 99.56-101.45%, 92.39-97.10%로 우수한 정확성을 나타내었다(Table 2).
검출한계 및 정량한계
검출한계와 정량한계는 ICH 가이드라인에 근거하였으 며 berberine 및 palmatine의 검출한계는 각각 0.32 μg/mL, 0.35 μg/mL로 측정됐으며 정량한계는 각각 0.97 μg/mL, 1.06 μg/mL로 나타났다. 이상의 결과를 통해 berberine 및 palmatine은 HPLC를 이용해 동시분석이 가능하며 정량분 석이 가능한 것으로 나타났다(Table 3). 이 결과는 식품의 약품안전평가원의 연구9)에 의해 보고된 berberine 및 palmatine의 검출한계인 0.17 μg/mL, 0.18 μg/mL과 정량한 계인 0.56 μg/mL, 0.59 μg/mL보다 높게 나타났으나 이는 사용한 기기와 분석조건의 차이에 의한 것으로 사료된다.
FRAP, reducing power 및 아질산염 소거능 활성
Fe3+를 Fe2+로 환원시키는 원리를 이용하는 FRAP assay 에서 흡광도 수치는 시료의 환원력을 나타내며, 높은 항 산화 활성을 가질수록 흡광도의 수치가 높게 나타난다. Berberine 및 palmatine의 농도를 0.25, 0.5, 1.0 mM로 하 여 항산화 활성을 측정한 결과는 Fig. 4와 같다. Berberine 은 0.53-2.06, palmatine은 0.55-2.09의 흡광도 값을 나타냈 으며, 양성대조군으로 사용한 ascorbic acid의 FRAP assay 에 의한 항산화 활성은 1.0 mg/mL의 농도에서 3.16의 흡 광도 값을 나타냈다. Reducing power activity의 측정 결과 는 FRAP의 결과와 같은 경향을 나타내었으며, 0.25, 0.5, 1.0 mM의 농도에서 berberine과 palmatine은 각각 0.20±0.01, 0.32±0.00, 0.44±0.01와 0.21±0.01, 0.32±0.01, 0.46±0.01의 결과를 나타냈다. Berberine 및 palmatine의 아질산염 소거 능은 농도 의존적으로 증가하여 1 mM의 농도에서 각각 61.50±2.01%와 56.31±4.00%의 값을 확인할 수 있었고 양 성대조군으로 사용된 ascorbic acid (0.5 mg/mL)에서는 75.94±0.19%의 결과를 나타냈다. 이는 Shirwaikar 등22)의 연구와 유사한 결과를 보였음을 확인할 수 있었다. 이 결 과들을 통해 berberine과 palmatine 모두 농도 의존적으로 환원력이 높아져 항산화 활성이 증가하였음을 알 수 있었 으며, palmatine의 항산화 활성이 berberine보다 더 우수함 을 확인할 수 있었다.