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ISSN : 1229-1153(Print)
ISSN : 2465-9223(Online)
Journal of Food Hygiene and Safety Vol.35 No.6 pp.561-566
DOI : https://doi.org/10.13103/JFHS.2020.35.6.561

Development and Validation of Multiplex PCR Method for the Identification of Pagrus major and Sciaenops ocellatus

Iseul Choi, Jiyoung Shin, Ji-young Yang*
Department of Food Science and Technology, Pukyoung National University, Busan, Korea
*Correspondence to: Ji-young Yang, Department of Food Science and Technology, Pukyong National University, Busan 48513, Korea Tel: +82-51-629-5828, Fax: +82-51-629-5824 E-mail: jyyang@pknu.ac.kr
October 13, 2020 November 4, 2020 November 13, 2020

Abstract


Nowadays, with increase of seafood consumption, there have been increasing reports of defective seafood products. There have been incidents of red drum (Sciaenops ocellatus) being sold as red seabream (Pagrus major). In this study, we sought to develop and validate species-specific PCRs to differentiate between P. major and S. ocellatus to prevent the sale of S. ocellatus as P. major. Primers for P. major were designed to bind 12s rRNA and those for S. ocellatus were designed to bind 16s rRNA. Multiplex PCR showed a 468 bp amplicon for P. major and a 181 bp amplicon for S. ocellatus. The limit of detection of P. major and S. ocellatus was present at 1 ng each. The developed primers were validated with 19 P. major samples of food items purchased through the internet. Using this monitoring method, the experimental results and tested species were in agreement. Hence, the developed multiplex PCR method is considered reliable to authenticate P. major and S. ocellatus.



참돔과 홍민어 판별을 위한 Multiplex PCR 검사법의 개발과 검증

최 이슬, 신 지영, 양 지영*
부경대학교 식품공학과

초록


참돔은 등쪽에 푸른 반점이 흩어져 있고, 홍민어는 꼬 리 쪽에 검은 점이 있어 원물 형태는 쉽게 구분할 수 있 다. 그러나 횟감이나 필렛으로 이용 시 참돔과 홍민어를 구분하기 어려워, 참돔의 종 특이 primer를 개발 및 검증 하고 모니터링을 통해 참돔의 위변조 사례를 조사하고자 하였다. 시료에서 gDNA를 추출하여 PCR을 진행하였으며 참돔 primer의 product size는 468 bp, 홍민어 primer의 product size는 181 bp으로 설계하였다. Multiplex PCR 결 과 참돔과 홍민어에 대한 종 특이적 증폭이 확인되었다. 또한, 참돔과 홍민어 PCR 민감도 실험 결과 참돔 primer는 1 ng, 홍민어 primer는 0.1 ng 까지 밴드가 확인되었다. 모 니터링 결과 참돔으로 구매한 시료 19건 모두 참돔으로 판정되었다. 따라서 본 연구에서 제작된 참돔과 홍민어 종 에 대한 종 특이적 primer는 횟감 등 수산물에도 적용할 수 있어 현재 유통 및 판매되고 있는 참돔 및 홍민어 판 별에 적합성을 확인하였다.



    Ministry of Food and Drug Safety(MFDS)
    17162미래사064

    최근 원재료를 값비싼 다른 원료로 속여 팔거나, 표시사 항을 허위로 기재하는 등의 불량식품 판매 사례가 있다1). 현재 불량식품은 식품의 생산, 제조, 유통 그리고 판매까 지 모든 단계에서 법을 위반한 제품으로, 최근에는 국민 에게 불안감을 주는 식품을 뜻한다. 이러한 불량식품은 국 민의 건강을 위협할 뿐만 아니라 식품유통 질서를 어지럽 히고 있다1). 특히 이종 혼합식품이나 가짜식품의 경우 가 공 시 외관이나 관능적인 방법으로 원재료의 판별이 어려 워, 가공 후에도 원재료 판별이 가능한 과학적인 판별법 이 필요하다. 원재료 판별법에는 단백질 분석법, 이화학적 분석법 및 유전자 분석법 등이 있다2). 단백질을 이용한 판 별법에는 등전점 전기영동(isoelectric focusing, IEF), 모세 관 전기영동(capillary electrophoresis, CE) 등이 있으며3), 이와 같은 단백질을 이용한 판별법은 열처리 및 건조 시 단 백질이 쉽게 분해될 수 있고, 단백질 변성에 의해 감수성이 떨어진다는 단점이 있어 가공식품에 적합하지 않다4,5). 이화 학적 분석법에는 고속 액체 크로마토그래피(High performance liquid chromatography, HPLC), 가스 크로마토그래피(gas chromatography, GC) 등이 있으며4), 크로마토그래피를 이 용한 판별법은 특정 물질의 정량 및 정성이 가능하지만 실험 방법이 복잡하고 고가의 장비를 사용해야 한다는 단 점이 있다4,6). 유전자 분석법을 이용한 판별법은 단백질 기 반의 판별법보다 특이성 및 감도가 높고, 단백질보다 열 에 강하여 가공 처리된 시료에서 보다 안정적인 결과를 얻을 수 있다7,8). 또한 중합효소 연쇄반응(Polymerase chain reaction, PCR)을 이용하여 일부 유전자를 증폭시키는 방 법은 신속성, 특이도, 민감도, 간편성 등이 우수하여 식품 원료 동정에 이용되고 있다9).

    참돔(Pagrus major)은 농어목(Perciformes) 도미과(Sparidae) 에 속하며 전 세계적으로 33속 155종으로 알려져 있다10). 참돔은 우리나라 전 연안과 일본, 중국, 하와이 등의 연안 에 분포하며11), 수심 30-150 m의 대륙붕 암초지대에서 주 로 서식한다12). 참돔은 회, 구이 등 다양한 고급 식재료로 이용되며11), 많은 수요로 인해 세계적으로 중요한 해양 어 종 중 하나이지만13), 횟감으로 이용 시 형태학적으로 구분 이 어려워 틸라피아, 홍민어 등을 참돔으로 속여 파는 불 량 식품 사례가 발생하고 있다14). 그 중 홍민어(Sciaenops ocellatus)는 농어목 (Perciformes) 민어과(Sciaenidae)에 속 하며 미국 대서양 연안 및 멕시코만 북부에 서식하는 온 대성 어종으로15,16), 참돔과 형태학적으로 유사하지는 않으 나 횟감이나 필렛으로 가공 처리 시 판별이 어려운 불량 식품 사례가 발생하고 있다14).

    현재까지 참돔과 홍민어 판별법으로는 SDS-전기영동을 이용한 실험법14)이 보고되었으나 전기영동 결과 어종 판 별에 특이적인 band가 나타나지 않아 새로운 어종 판별 기술이 필요할 것으로 보고하고 있다14). 따라서 PCR을 이 용하여 참돔과 홍민어를 구분하고자 하였다.

    현재 PCR을 이용한 진위판별법에는 옥돔과 옥두어 유 전자 분석법4), 전갱이속 어종 판별법17), 참서대과 어종 판 별법18) 등이 있으며, real-time PCR을 이용한 판별법으로 는 옥돔과 옥두어 판별법3), 두족류의 진위판별법19) 등이 있다. Real-time PCR은 기존의 PCR보다 감도가 높고 신 속성이 있다는 장점이 있지만3), 고가의 시약과 장비가 필 요하고 multiplex PCR 실험법에 비해 두 배의 노동력과 시약이 필요하다는 단점이 있다4).

    따라서, 본 연구에서는 형태학적으로 유사하지 않지만 회나 필렛 등으로 가공 처리 시 유사식품으로 판매될 수 있는 참돔과 홍민어의 종 특이 primer를 개발하고, 개발된 판별법의 검증 및 모니터링을 통해 참돔으로 위변조 된 사례를 사전에 예방할 수 있는 분석법을 확립하고자 하였다.

    Materials and Methods

    재료

    표준시료로 사용된 참돔(P. major)과 홍민어(S. ocellatus) 는 부산 자갈치 시장에서 구매하였다. 시료는 모두 형태 학적으로 판별이 완료된 시료를 사용하였다. 모니터링에 사용된 참돔 시료는 시중에 유통 중인 필렛 제품을 구매 하여 사용하였다. 표준시료와 모니터링 시료의 경우 구입 후 조직을 채취해 에펜도르프 튜브에 담은 후 -80°C에서 보관하였다.

    Genomic DNA 추출

    각 시료의 genomic DNA는 POWERPREPTM DNA Extraction from Food and Feed Kit (Kogenbiotech, Seoul, Korea)를 사용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 추출하였다. 추출한 genomic DNA의 농도는 OptizenTM NanoQ (K Lab Kiswire, Daejeon, Korea)을 이용하여 측정하였다.

    종 특이 primer 제작

    참돔과 홍민어의 판별법 개발을 위한 16s rRNA, 12s rRNA 유전자의 염기서열은 National Center for Biotechnology Information (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov)에 등록된 미 토콘드리아 전체 염기서열로부터 확보하였다. 참돔(P. major) 은 AP002949, 홍민어(S. ocellatus)는 NC_016867의 유전 자 염기서열을 선정하였다. 확보된 참돔과 홍민어의 미토콘 드리아 DNA 서열 중에서 16s rRNA, 12s rRNA 유전자 염 기서열을 이용하여 유전자 서열을 정렬하였으며 염기서열 의 정렬은 clustal omega (EMBL, https://www.ebi.ac.uk/ Tools/msa/clustalo/)를 이용하였다. Primer는 150-500 base pair가 되도록 하였고, Tm 값은 58-60°C의 범위를 가지며 GC 비율 30-37%를 고려하여 종 특이 primer를 설계하였 다(Table 1).

    Polymerase chain reacion (PCR) 반응

    PCR 반응액은 각각 genomic DNA 1 μL, forward primer 1 μL, reverse primer 1μL, prime taq premix (2X) (GENETBIO, Daejeon, Korea), 멸균증류수 17 μL를 포함하 여 총 용량이 20 μL가 되도록 하였다. PCR 반응은 AllInOneCyclerTM (Bioneer, Daejeon, Korea)를 이용하여 PCR을 진행하였다. PCR 조건은 initial denaturation을 95°C 에서 5분 실시 후, denaturation을 95°C에서 20초, annealing 을 56°C에서 20초, extension을 72°C에서 30초로 30 cycle 을 반복하고 최종적으로 extension 72°C에서 5분간 실시 하여 PCR을 종료하였다(Table 2). 증폭된 PCR 산물은 1.5% 아가로즈 겔에 PCR product 2 μL를 로딩하고 110 V에서 20분간 전기영동을 하였다.

    또한, 프라이머의 비특이적 반응을 알아보기 위해 negative control로 멸균증류수 17 μL forward primer 1 μL, reverse primer 1 μL를 넣어 확인하였다.

    종 특이 primer의 검출 한계

    종 특이 primer의 민감도는 참돔과 홍민어 표준시료의 genomic DNA 농도가 100 ng, 10 ng, 1 ng, 0.1 ng가 되도 록 희석하였다. 희석된 DNA를 single PCR과 multiplex PCR의 template DNA로 실험을 진행하였다.

    모니터링

    홍민어를 참돔으로 위변조하여 판매되는 현황을 알아보 기 위해 참돔 필렛시료를 19건 구입 후 본 실험에서 개발 된 multiplex PCR 판별법을 이용하여 모니터링을 실시하 였다. 실험결과의 판정은 참돔(468 bp) band가 증폭되었 을 때 참돔 양성으로 판정하였다.

    Results and Discussion

    참돔과 홍민어의 형태학적 분류

    참돔과 홍민어를 생물 및 필렛 처리 후 형태는 Fig. 1 과 같았다. 참돔은 등쪽에 작은 파란색 반점이 흩어져 있 고, 홍민어는 꼬리 쪽에 점이 있는 것이 가장 큰 특징으 로 원물 형태는 쉽게 비교가 가능하지만, 필렛 형태인 Fig. 1 BE 및 횟감 형태인 Fig. 1 CF를 구분하는 것은 어려운 것을 볼 수 있다. 이는 참돔과 홍민어 모두 붉은 빛을 띠기 때문인데, 자세하게 살펴보면 홍민어에는 참 돔과 다르게 빗살 무늬가 여러 개로 갈라져 있는 것을 볼 수 있으나 이러한 형태적 특징만으로는 구분이 어려 워, multiplex PCR을 통해 참돔과 홍민어를 구분할 수 있었다.

    종 특이 프라이머 설계

    참돔과 홍민어 염기서열분석은 미국 국립보건원에서 운 영하고 있는 유전자은행(www.ncbi.nlm.nih)에 등록 된 염 기서열을 이용하여 프라이머를 설계하였다(Table 1). 설계 된 프라이머를 이용하여 실험한 결과는 Fig. 2와 같았으 며 참돔은 468 bp, 홍민어는 181 bp에서 증폭 산물을 확 인하였다.

    Single PCR 및 multiplex PCR 특이도

    Single PCR 결과는 Fig. 2에 나타내었으며, Multiplex PCR 결과는 Fig. 3에 나타내었다. 실험 결과 참돔 primer 는 참돔 template DNA만을 증폭하였고, 홍민어 primer는 홍민어 template DNA만을 증폭하였다. 참돔과 홍민어 primer에서 negative control은 증폭하지 않은 것을 볼 수 있으며 이를 통해 참돔과 홍민어에 적합한 종 특이 primer 가 개발되었음을 확인하였다.

    Multiplex PCR 민감도

    설계된 참돔과 홍민어 primer의 민감도는 Fig. 4에 나타내었으며, 참돔 primer의 민감도는 1 ng, 홍민어 primer의 민감도는 0.1 ng 까지 검출이 확인되었다. PCR 분석법에서 template DNA 농도는 보통 10 ng으 로 설정하고 있고, 본 실험에서는 민감도가 0.1-1 ng 으로 나타나 PCR 실험의 일반적인 민감도를 만족함을 알 수 있었다4).

    모니터링

    본 실험에서는 개발된 multiplex PCR을 이용해 시중에 서 판매되고 있는 참돔 필렛 시료 19건을 구입하여 모니 터링 하였으며 전기영동 결과는 Fig. 5에 나타내었다. 참 돔의 양성 판정 결과는 Table 3에 나타내었으며 시료 19 건 모두 참돔으로 판정되어 실험시료와 결과가 100% 일 치함을 확인하였으며, 참돔의 위변조 사례는 조사된 경우 에는 나타나지 않았다.

    참돔은 회, 반건조 등의 형태로 판매되고 있어 형태학 적으로 판별이 어렵다. 따라서 multiplex PCR 판별법이 유 통 및 판매되고 있는 참돔 판별에 적합함을 확인할 수 있 었다.

    Acknowledgement

    본 연구는 2020년도 식품의약품안전처의 연구개발비 (17162미래사064)로 수행되었으며 이에 감사드립니다.

    Figure

    JFHS-35-6-561_F1.gif

    Morphological comparison of Pagrus major and Sciaenops ocellatus.

    (A) the original of P. major (B) fillet of P. major (C) sashimi of P. major (D) the original of S. ocellatus (E) fillet of S. ocellatus (F) sashimi of S. ocellatus.

    JFHS-35-6-561_F2.gif

    Single PCR result of P. major and S. ocellatus. Lane 1; negative control, Lane 2; P. major gDNA + P. major species-specific primers, Lane 3; P. major gDNA + S. ocellatus species-specific primers, Lane 4; S. ocellatus gDNA + P. major speciesspecific primers, Lane 5; S. ocellatus gDNA + S. ocellatus species- specific primers, M; size marker(100 bp).

    JFHS-35-6-561_F3.gif

    Multiplex PCR result of P. major and S. ocellatus. Lane 1; negative control, Lane 2; P. major gDNA + P. major species-specific primers + S. ocellatus species-specific primers, Lane 3; S. ocellatus gDNA + P. major species-specific primers + S. ocellatus species-specific primers, M; size marker(100 bp).

    JFHS-35-6-561_F4.gif

    Multiplex PCR sensitivity of P. major and S. ocellatus. Lnae 1; P. major 100 ng, Lane 2; P. major 10 ng, Lane 3; P. major 1 ng, Lane 4; P. major 0.1 ng, Lane 5; S. ocellatus 100 ng, Lane 6; S. ocellatus 10 ng, Lane 7; S. ocellatus 1 ng, Lane 8; S. ocellatus 0.1 ng, M; size marker(100 bp).

    JFHS-35-6-561_F5.gif

    Multiplex PCR monitoring results. Lane 1; negative control, Lane 2-20; P. major, M; size marker(100 bp).

    Table

    Primer sequence for detection of P. major designed in this study

    PCR reaction conditions of P. major and S. ocellatus primer

    Monitoring results of P. major on online shopping mall

    Reference

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