2017년 7월, 네덜란드와 벨기에의 일부 계란 중 살충제 농약 성분인 피프로닐(fipronil)의 검출이 보고되면서, 이 살충제에 오염된 계란을 수입한 독일, 스웨덴, 스위스, 영 국, 프랑스 등에서도 계란에서 피프로닐이 검출되었다¹⁾. 한국에서도 8월부터 계란 중 잔류 농약 실태를 파악한 결 과 DDT, bifenthrin, etoxazole, flufenoxuron, pyridaben, 피 프로닐 등이 검출되었다²⁾. 이 중 bifenthrin을 제외한 DDT, etoxazole, flufenoxuron, pyridaben, 피프로닐은 식품의 기 준 및 규격³⁾에서 계란에 대한 잔류허용기준이 설정되어 있지 않은 농약들이었으나, 이후에 한국에서도 계란에 대 한 잔류허용기준을 설정하였다. 특히 피프로닐은 닭 진드 기 방제를 위한 살충제로 사용되었으나, 현재 강한 독성 으로 인해 축산물에서의 사용이 금지된 물질이다⁴⁾.

닭 진드기(Dermanyssus gallinae)는 가금류에 기생하여 흡혈하는 외부 기생충으로서 전 세계적으로 분포하며 각 종 가금질병들을 매개하는 해충이다⁵⁾. 많은 산란계 농가 가 사육 방식에 관계없이 닭 진드기에 감염된 것으로 보 고되고 있으며, 특히 유럽연합(약 83%)⁶⁾과 일본(약 85%)⁷⁾ 에서는 산란계 농가의 닭 진드기 감염률이 높은 것으로 추정되고 있다. 한국의 경우에는 2017년 조사에서 약 94% 정도가 닭 진드기에 감염이 된 것으로 확인되었다⁸⁾.

닭 진드기로 인한 피해로는 산란계에서 흡혈로 인한 스 트레스⁹⁾, 산란율 저하, 세균 및 바이러스성 질병 전파^8,10), 농장 관리자의 소양증 및 알레르기성 피부염 야기¹¹⁾ 등이 있다. 닭 진드기는 늦은 밤 30분에서 1시간 30분 정도로 짧은 시간 동안 흡혈한 후, 계사의 틈이나 계란 운반용 벨 트, 케이지 등에 숨어 있기에 방제하기가 매우 까다로우 며, 흡혈하지 않고도 4-5개월 동안 생존이 가능하기 때문 에 재발생 확률이 매우 높다¹²⁾.

닭 진드기는 주로 카바메이트계, 유기인계, 피레스로이 드계 등의 화학적 방제에 의존해 왔으나 무분별하고 반복 적인 살비제의 사용으로 각종 방제제에 대한 내성이 형성 되면서 닭 진드기 방제에 문제가 발생하고 있다^8,13). 2015 년 일본의 양계농가에서 fenitrothion, permethrin, carbaryl 등 유기인계, 피레스로이드계, 카바메이트계 약제에 대한 내성이 보고되었고, 스웨덴에서는 permethrin에 대한 내성 이 발현되었다는 보고가 있었다^13,14). 또한, 이러한 살비제 의 무분별한 사용은 내성 발현 뿐만 아니라 닭과 계란에 서 잔류됨으로서 공중보건학적 문제를 야기하였다¹⁵⁾.

이에 많은 국가에서 닭 진드기 방제를 위해 농약 잔류 위험이 없는 천연 살비제의 개발을 추진하였고 essential oil¹⁶⁾, silca¹⁷⁾, 식물추출물¹⁸⁾ 등을 이용한 닭 진드기 제어 연구들이 진행되었다.

본 연구에서는 편백유와 계피유를 주성분으로 한 닭 진 드기 구제 살비제와 관련하여, 산란계와 작업자의 피부접 촉으로 인한 안전성을 확인하기 위해 농림축산검역본부 고 시 제2016-22호 “동물용의약품등 독성시험지침”¹⁹⁾ 및 식품 의약품안전청 고시 제2017-71호 “의약품 등의 독성시험기 준”²⁰⁾에 따라 각각 피부자극성 및 감작성 평가를 수행하였다.

Materials and Methods

실험물질

본 시험에 사용된 시험물질은 ㈜칼텍바이오(Pocheon, Korea)에서 공급받은 주성분이 편백유(20%)와 계피유(56%) 인 와구잡이 II^® 용액(WGJB)을 사용하였다. 물질은 투명 한 갈색의 액체로서 사용기간 동안 실온에 보관하였고, 투 여 시, 올리브 오일(Merck KGaA, Darmstadt, Germany)을 사용하여 농도를 조절하였다.

실험동물

피부자극성 평가와 피부감작성 평가를 위해, 건강한 수 컷 New Zealand White Rabbit (1.9-2.2 kg) 6마리와 건강 한 수컷 Dunkin-Hartley guinea pigs (330-400 g) 17마리를 (주)샘타코바이오코리아(Sam-taco Bio Korea, Osan, Korea) 에서 구입하여 시험에 사용하였다. 실험동물은 사육실 및 실험실 환경에서 2주간 적응시킨 후 시험에 사용하였다. 동물실험은 경상대학교 동물실험윤리위원회의 사전 승인 를 받아 동물실험윤리위원회의 규정에 따라 수행하였다 (GNU-200316-G0013).

사육환경

온도는 25 ± 2°C, 상대습도 50 ± 10%, 조명시간 12시간(오 전 7시 점등 오후 7시 소등), 환기횟수 10-13회/h 및 조도 150-200 Lux로 설정된 경상대학교 부설 중앙동물실험실에서 사육하였다. 사육환경 모니터링을 위하여 온·습도는 매시간 측정하였으며, 기타 환경은 정기적으로 측정하였다. 사료는 실험동물용 토끼사료 및 기니픽사료 (㈜애그리브랜드 퓨리 나코리아, 서울)를 자유 급여하였고, 기니픽에는 vitamin C 의 공급을 위해 ascorbic acid (220 mg/L) 함유 살균 정제수 와 양배추를 자유롭게 섭취하도록 하였다. 토끼는 3단 사육 상자대에 배열된 스테인레스 스틸 사육케이지(42 × 50 × 31 cm) 에서 사육상자 당 1마리씩 수용하여 사육하였으며, 기니픽 은 스테인레스 스틸 사육케이지(26 × 42 × 18 cm)에서 사육 상자 당 1마리씩 수용하여 사육하였다.

피부자극성 평가

시험개시 24시간 전에 토끼의 등에 상처가 생기지 않도 록 전기제모기와 면도기를 이용하여 털을 제거하였다. 시 험 당일 제모한 등에 척추의 좌우 약 2 cm 떨어진 부위에 전후 약 4 cm 거리를 두고 각각 두 부위씩 2.5 × 2.5 cm의 사각형을 그려 표시해 두었다. 표시된 네 부위 중 오른쪽 두 부위를 주사기 바늘을 이용하여 대각선 방향으로 각질 층만 손상되고 진피는 손상되지 않으며 피가 나지 않을 정도의 찰과상을 내었다(Fig. 1).

토끼의 앞쪽 두 부위(찰과 및 비찰과 부위)는 증류수를 도포하고 대조 부위로 하였고, 나머지 두 부위는 WGJB 0.5 mL을 피부에 골고루 도포하고, 시험 부위 전체를 3겹 의 거즈로 덮고, 탄력붕대로 감싼 다음 3M 종이테이프로 가장자리를 잘 고정하였다.

시험물질 도포 24시간 후 거즈를 제거하고 피부에 영향 을 미치지 않도록 잔류 시험물질을 미온수로 씻어내었다. 시험물질 도포 부위를 세정한 후, 24시간, 48시간 및 72 시간 후에 피부반응을 “동물용의약품등 독성시험지침”의 “피부자극반응 평가표”(Table 1)에 따라 평가하여¹⁹⁾, 피부 1차 자극지수(primary irritation index, P.I.I.)를 산출하여 (Table 2), 자극성을 판정하였다.

피부감작성 평가

기니픽 10마리씩을 사용하여 1군으로 구성하여, 시험물 질 투여군과 용매 대조군(올리브 오일 처리)으로 구성하 여 실험을 수행하였다. 시험개시 전 기니픽의 등을 상처 가 나지 않도록 4 × 4 cm의 크기로 전기제모기와 면도기 를 이용하여 털을 제거하여 두었다. 1차 감작노출을 위해 제모한 기니픽의 등 부위 피부(2 × 4 cm)에 Fig. 2와 같은 3종의 시료를 좌우 대칭으로 0.1 mL씩 피내주사 하였다.

시험물질은 5단계(50, 25, 12.5, 6.25, 3.125%)로 희석하 여 사용하였으며, 각각의 농도에 대하여 2마리씩의 기니 픽을 사용하였다. 피내주사 24시간 후에 주사부위를 관찰 하여 2마리 기니픽 모두에서 피부 괴사가 나타나지 않은 최고농도를 감작 항원량으로 하였다. 2차 감작노출은 1차 감작 1주 후 시험물질을 피내주사 했던 부위에 시험물질 을 포함하는 패취(patch, 2 × 4 cm)를 부착하여 48시간 동 안 폐색첩포하였다. 폐색첩포 후, 2마리 기니픽 모두에서 괴사가 나타나지 않는 최대농도를 감작항원량으로 하였으 며, 홍반이 나타나지 않는 최대 농도를 야기항원량으로 사 용하였다.

감작 야기는 폐색첩포 2주 후에 시험동물의 측복부를 제모하고 시험물질을 포함하는 패취(patch, 2 × 2 cm)를 Fig. 2와 같이 부착하여 24시간 동안 폐색첩포하여 감작을 야 기시켰다. 감작항원량은 3%로 나타났으며, 감작 야기항원 량은 2차 감작에서 홍반이 나타나지 않은 최대농도인 2% 를 사용하였다.

패취(patch)를 제거하고 피부감작성 평가 3시간 전에 미 온수로 피부에 남아 있는 시험물질을 깨끗이 닦아 내었다. 감작 야기 후 24시간 및 72시간에 “의약품 등의 독성시험 기준”의 “피부감작반응 평가표”(Table 3)에 따라 반응을 평 가하였으며²⁰⁾, 반응이 나타난 개체를 양성동물수로 하여 감작률을 구하고(Table 4), 피부감작 등급을 판정하였다²⁰⁾.

Results and Discussion

피부자극성 평가

WGJB 도포 24시간 후, 거즈를 제거하고 피부에 영향을 미치지 않도록 잔류 시험물질을 미온수로 씻어낸 다음, 3 일간의 관찰기간 동안 시험물질 도포로 인한 특이한 일반 증상 및 사망 예는 관찰되지 않았다(Data not shown).

WGJB 도포 후 도포부위의 잔류 시험물질을 미온수로 씻어낸 다음 24시간 후 관찰결과, 1마리는 심한 홍반, 2 마리는 분명한 홍반, 1마리는 아주 가벼운 홍반이 관찰되 었다. 48시간 후 관찰결과, 시험물질처리 실험동물의 찰과 부위에서, 2마리는 분명한 홍반, 2마리는 아주 가벼운 홍 반이 관찰되었다. 72시간 후 관찰결과, 시험물질처리 실험 동물 1마리의 찰과부위에서 아주 가벼운 홍반이 관찰되었 다(Table 5).

이러한 관찰결과로부터 피부 1차자극지수(P.I.I.)를 산출 한 결과, WGJB의 P.I.I.는 “0.625”로 “약한 자극성 물질” 로 평가되었다.

앞선 연구²¹⁾에서, 편백정유에 대하여 피부자극성 평가를 수행한 결과, P.I.I.이 0.17로 피부자극성을 없었다고 보고 하였다. 이는 본 연구에서 사용한 WGJB의 편백정유 함 량이 20%인 점을 고려하면 5배 정도 높은 농도에 해당된 다. 한편, 계피정유를 이용한 피부자극성 평가에서는 계피 정유의 P.I.I.가 4.0으로 중등도의 피부자극성 물질이라고 보고하였는데²²⁾, 이는 계피정유 성분 중 65-80%를 차지하 고 있는 cinnamaldehyde에 의한 것으로 보고되고 있다^23,24). 본 시험에 사용한 WGJB의 조성(편백정유 : 계피정유 = 20 : 56)을 고려했을 때, WGJB의 약한 피부자극성은 앞 선 연구결과들과 유사한 경향성을 보이고 있는 것으로 판 단된다.

피부감작성 평가

1, 2차 감작 및 감작야기 기간 동안 용매대조군(올리브 오일)과 시험물질인 WGJB 투여군에서 일반증상이 관찰 되지 않았으며, 체중변화에서도 용매대조군에 비해 시험 물질 투여군에서 유의성 있는 차이는 관찰되지 않았다. 또 한 용매대조군과 시험물질 투여군 모두에서 사망한 실험 동물은 없었다(Data not shown).

감작 야기 후 피부감작성 평가기준에 따른 용매대조군 과 실험물질 투여군의 24시간 및 48시간째의 감작점수는 모두 0점(무반응)이었고, 피부감작률 또한 24시간 및 48시 간째 용매대조군과 시험물질 투여군 모두 등급 ‘I(매우 약 함)’로 판정되었다(Table 6).

Hwang 등²⁵⁾의 편백정유에 대한 피부감작성 평가 결과 에 따르면, 편백정유는 감작야기 후 24시간과 48시간에 피 부반응 점수는 모두 0점(무반응)으로 나타났으며, 피부감 작률도 모두 0%로 나타나 편백정유가 ‘I(매우 약함)’등급 으로 분류되었다고 보고하였다. 한편, 계피정유에 의한 피 부감작성은 보고된 바가 없으나, 신선한 계피정유 성분 중 80% 이상을 차지하고 있는 cinnamaldehyde에 의한 피부 감작성들이 보고되고 있다^26,27). 본 시험에서 사용한 WGJB 의 구성 성분 중 56%를 차지하는 계피정유가 피부감작성을 유발하므로 본 연구에서 WGJB의 피부감작성은 ‘II(약함)’ 등급 이상을 나타내어야 할 것으로 판단되나, ‘I(매우 약함) 등급을 나타낸 것은 계피정유 성분 중 cinnamaldehyde의 함 량이 낮았던 것으로 사료된다. 이는 산지에 따라 계피 성 분들의 함량이 차이를 보이기 때문이다²⁸⁾.

이상의 연구 결과를 종합해 볼 때, 편백정유와 계피정 유를 주성분으로 하는 WGJB는 임상 적용 시 본 약제에 의한 자극성 및 면역반응에 의한 감작성 부작용을 유발하 지 않을 것으로 판단된다.

국문요약

본 연구는 닭 진드기 구제를 목적으로 개발된 살비제인 와구잡이 II^® (WGJB, 편백정유 : 계피정유 = 20 : 56)에 대하여 토끼와 기니픽을 이용하여 피부 자극성 및 감작성 평가를 각각 수행하였다. 일차피부자극시험에서 토끼의 피 부에 WGJB를 24시간 동안 처리한 후 피부 자극성을 확 인한 결과, WGJB는 비찰과 부위에서 홍반과 부종과 같 은 어떠한 부작용도 일으키지 않았으나, 몇몇 토끼의 찰 과 부위에서 매우 약한 홍반과 부종을 나타내어 WGJB의 1차 피부자극 지수는 0.625이었다. 따라서 WGJB는 약한 자극성이 있는 물질로 분류되었다. 피부감작성 시험에서 기니픽에 0.1 mL의 WGJB을 피내주사한 후 24시간 동안 감작시켰다. 감작 1주일 후 WGJB를 함유한 패취를 주사 부위에 부착하여 48시간 동안 처리한 다음, 2주 후에 WGJB 를 함유한 패취를 부착하여 감작을 야기시켰다. WGJB는 어떠한 알러지 반응도 나타내지 않았다. 따라서, 본 연구를 통하여 WGJB는 약한 피부 자극성을 가지며 감작성을 야 기하지 않는 물질로 평가되었다.