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ISSN : 1229-1153(Print)
ISSN : 2465-9223(Online)
Journal of Food Hygiene and Safety Vol.36 No.2 pp.141-147
DOI : https://doi.org/10.13103/JFHS.2021.36.2.141

Comparison of Conventional PCR and Multiplex Real-Time PCR Assay for Detection of Staphylococcus aureus and Bacillus cereus
in Ready-to-Eat Foods

Yu-Si Lee, Seokhwan Kim, Migyeong Kim, Soon Han Kim*
Food Microbiology Division, National Institute of Food and Drug Safety Evaluation, Ministry of Food and Drug Safety, Cheongju, Korea

Both authors contributed equally to this work.


* Correspondence to: Soon Han Kim, Food Microbiology Division, National Institute of Food and Drug Safety Evaluation, Ministry of Food and Drug Safety, Cheongju 28159, Korea Tel: +82-43-719-4305, Fax: +82-43-719-4300 E-mail: lambndog@korea.kr
January 14, 2021 March 24, 2021 April 7, 2021

Abstract


In the present study, the performance of different PCR assays was compared for the rapid detection of S. aureus and B. cereus in ready-to-eat foods such as sandwiches. The limit of detection (LOD) and specificity of two assays (conventional PCR and real-time PCR) were compared. The LOD of real-time PCR ranged from 103 to 106 CFU/mL for S. aureus and from 102 to 105 CFU/mL for B. cereus. The LOD of conventional PCR ranged from 104 to 106 CFU/mL for S. aureus and from 103 to 105 CFU/mL for B. cereus. The LOD of real-time PCR assay for S. aureus and B. cereus in sandwiches ranged from 104 to 106 CFU/mL and from 103 to 105 CFU/mL, while the LOD of conventional PCR was from 104 to 106 CFU/mL and from 103 to 105 CFU/mL, respectively. The LOD of the real-time PCR was 10-fold higher than that of the conventional PCR. In conclusion, these results show that real-time PCR could be used as an effective screening test for the rapid detection of S. aureus and B. cereus in sandwiches compared to conventional PCR.



즉석 섭취 식품에서 Staphylococcus aureusBacillus cereus 검출을 위한 Conventional PCR과 Real-Time PCR법 비교

이 유시, 김 석환, 김 미경, 김 순한*
식품의약품안전처 식품의약품안전평가원 식품위해평가부 미생물과

초록


    Ministry of Food and Drug Safety(MFDS)
    16161위생안023

    최근 즉석 섭취 및 신선편의식품의 소비가 증가함에 따 라, 이들 식품 섭취에 의한 식중독 발생 위험도 함께 증 가하고 있다1-5). 특히 Bacillus cereusStaphylococcus aureus등 식중독 세균이 각종 식품에서 검출되면서 식중 독 예방을 위해 이들 식중독 세균에 대한 주의가 요구되 고 있다1,6-10).

    S. aureus는 식중독을 일으키는 주요한 원인균 중 하나 로 자연계에 광범위하게 분포하며, 동물이나 사람의 화농성 병소뿐만 아니라 건강한 사람과 동물의 피부 등에도 상재 하고 있어 식품과 인체에 오염될 가능성이 매우 높다11-12). S. aureus는 식품 내에 증식하면서 내열성 장독소(enterotoxin) 를 생성하여 식품을 섭취할 때 함께 장독소를 섭취하여 설 사, 위경련, 구토를 동반하는 독소형 식중독을 일으킨다11-13). 이는 식중독을 유발하는 병원성 인자로 면역학적 분류에 따라 enterotoxin A, B, C, D, E, F, G, H, I, J형으로 분류 되며, 주로 A형이나 D형에 의한 식중독 사례가 많은 것 으로 보고되고 있다10,14).

    한편 B. cereus는 토양, 먼지, 물 등 자연계에 널리 분포 하여 농작물 등의 식품을 섭취할 때 식중독을 일으킬 수 있는 병원성 세균이다15). 이 균은 내열성 포자를 생산하는 데, 식품에서 포자가 형성되면 가열 조리 과정에서도 사 멸하지 않고, 환경 변화에 따라 포자가 발아되고 균이 성 장하며 생성된 독소에 의해 식중독을 일으킬 수 있다1,16). B. cereus로 인한 식중독은 균이 체내에서 성장하는 동안 생성된 장독소에 의한 설사형(diarrhoeal type)과 B. cereus 균이 식품에서 영양 세포 상태로 성장하는 동안 생성된 구토독소(emetic toxin)에 의한 구토형(emetic type)으로 구 분할 수 있다1,17). 설사형 식중독은 설사와 복통이 주 증상 으로 NHE (non-hemolytic enterotoxin), HBL (hemolysin BL), CytK (cytotoxin K), BceT (enterotoxin T)와 EntFM (enterotoxin FM) 등의 enterotoxin이 관여하며, 구토형 식 중독은 emetic toxin (cereulide, CER)이 짧은 잠복기를 거 쳐 구토와 복통 등의 증상을 유발한다18-20).

    식중독 세균을 검출하기 위한 전통적인 방법으로는 배 양법 및 생화학적 확인검사법이 사용되고 있다. 하지만 이 시험법은 증균배양부터 생화학적 확인검사까지 많은 시간 과 노동이 소요되기 때문에, 대규모 식중독 사고가 발생 했을 때 신속하게 식중독 원인균을 검출하여 식중독 확산 을 차단하는 데 어려움이 있었다21,22). 이러한 단점을 보완 하여 식중독 세균을 신속하게 검출하기 위해 식중독 세균 의 특정 유전자 검출에 기반한 PCR법이 활용되고 있다22). 특히 conventional PCR (cPCR)보다 추가적인 전기영동 확 인 과정 없이 실시간으로 검출 결과를 확인 할 수 있는 real-time PCR이 신속검출기법으로 여러 분야에서 활용되 고 있다23-27). 따라서 본 연구에서는 즉석 섭취 식품에서 식중독을 유발할 수 있는 S. aureusB. cereus의 신속 검출을 위해 독소 유전자를 타겟으로 하는 cPCR과 realtime PCR 사이의 특이도 및 민감도를 비교 검증하였다. 또한 즉석 섭취 식품 중 샌드위치를 시료로 선정하여 대 상균을 인위접종하여 두 PCR법 사이의 민감도를 확인하 였다.

    Materials and Methods

    사용 균주와 DNA 추출

    본 연구에 사용한 균주는 Staphylococcus aureus 89종과 Bacillus cereus 78종이다. 실험 균주는 초저온 냉동고에서 보관된 균주를 해동한 뒤, Tryptone Soya Agar (Oxoid, Basingstoke, Hampshire, UK)에 획선 도말(streaking)하여 37°C에서 24±2시간 배양하였다. 실험 균주는 DNA 추출 을 위해서 단일 집락(colony)을 취하여 자동화 장비 (Nanobiosys UltraFast Prep G2-16TU, Nanobiosys, Seoul, Korea)를 이용해 DNA를 추출하였고, Nanodrop 2000 spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific Inc., Wilmington, DE, USA)를 이용하여 DNA 순도를 확인한 후 이를 DNA template로 사용하였다.

    민감도 및 특이성 평가

    S. aureus 검출을 위해 enterotoxin 유전자인 sea, seb, sec, sed, see, seg, seh, sei 유전자와 B. cereus 검출을 위 해 bceT, hblC, nheA, CER, cytK, entFM 유전자를 타겟으 로 하는 cPCR28) 및 주문 제작한 real-time PCR 키트 (Kogenbiotech Co., Ltd., Seoul, Korea)를 사용하였다. Real-time PCR 민감도(LOD) 측정을 위해 DNA를 추출한 후, 이를 통하여 얻은 DNA를 농도별 (101-106 copies/μL)로 단 계 희석하여 유전자증폭기(7500 Fast real-time PCR, Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA)를 이용하여 수 행하였다. 타겟이 되는 유전자를 보유하고 있는 양성대조 균주로써 S. aureus ATCC 23235 (sea, seb, sed), S. aureus ATCC 19095 (sec, seg, she, sei), S. aureus KCCM 41324 (see), B. cereus ATCC 12480 (bceT, hblC, nheA), B. cereus NCCP 14043 (CER, Cytk, entFM)을 사용하였다. 두 시험 법의 특이도(specificity) 평가를 위해 S. aureus 50종과 non- S. aureus 39종 및 B. cereus 50종과 non-B. cereus 28종을 이용하였고, 이를 두 가지 시험법 cPCR과 real-time PCR 로 확인하였다.

    검출한계 비교

    각 시험법의 검출한계(limit of detection)는 순수 배양액 및 식품에 세균 접종을 함으로써 확인하였다. 순수 배양액 에서는 Tryptone Soya Broth에서 37°C, 24시간 배양된 균 을 0.85% 생리식염수로 10배씩 단계 희석 (101-106 CFU/ mL)하였다. 균수 확인은 희석액을 Tryptone Soya Agar 에 도말하여 37°C, 24시간 배양 후 측정하였다. 또한 식품에 서는 즉섭섭취식품인 샌드위치(5종)에 단계 희석한 대상 균 배양액 1 mL을 접종 시켜 30초간 균질화하였다. 순수 배양액과 식품에 접종한 시료에서 단계희석액을 취하여 앞에서 언급한 바와 같이 동일한 방법으로 DNA를 추출 하여 두 시험법을 실시하였다.

    Conventional PCR 조건

    cPCR을 이용한 S. aureusB. cereus의 독소 유전자를 검출하기 위하여 수인성식품매개질환 실험실 진단 실무 지침의 방법을 따랐다28). cPCR은 SensoQuest LabCycler (SensoQuest GmbH, Gottingen, Germany)를 사용하였으 며, AccuPower PCR Premix (Bioneer, Daejeon, Korea)에 추출한 DNA 5 μL와 forward와 reverse primer (10 pmol) 각각 1 μL를 혼합하여 최종 용량이 20 μL가 되도록 하였 다. 반응 조건은 S. aureus의 경우 95°C에서 10분 가열한 뒤, 95°C에서 30초, 58°C에서 30초, 72°C에서 30초로 35 회 반복하였고, 72°C에서 10분간 더 반응시켰다. B. cereus 의 경우 94°C 5분, 94°C 30초, 55°C 30초, 72°C 1분의 cycle를 35회 반복한 후, 72°C에서 10분을 더 하여 총 1 시간 15분 정도 소요되었다. 추가적으로 cPCR 반응이 끝 난 산물은 전기영동을 실시하여 증폭된 특이적인 밴드를 확인하였다.

    Real-time PCR 조건

    Real-time PCR의 경우 S. aureusB. cereus 모두 주문 제작한 키트(Kogenbiotech Co., Ltd., Seoul, Korea)를 사 용하였다. 제조사에서 제시한 방법에 따라 혼합물에 template DNA 5 μL를 넣어 총 20 μL로 유전자증폭기(7500 Fast real-time PCR, Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA) 를 실시하였다. 반응은 multiplexing 조건에서 50°C 2분, 95°C 10분, 95°C 15초, 60°C 1분의 cycle로 40 cycles 반 응시켰으며, 총 1시간 20분 정도 소요되었다. 민감도 비교 를 위해 real-time PCR 결과는 cPCR의 증폭 cycles와 동 일하게 CT (cycle threshold) 값 35 이하인 경우 양성으로 판단하였다.

    Results and Discussion

    cPCR과real-time PCR의 특이도 및 검출한계 비교

    cPCR과 real-time PCR의 특이도(specificity)를 확인하기 위하여 총 89종 S. aureus와 78종 B. cereus를 대상으로 실험하였다. 특이도 시험 결과 각각의 표적유전자에 대해 두 시험법 모두 동일한 결과를 나타내었다(Table 1, 2). 총 50주 B. cereushblC 31주, nheA 28주, entFM 36주, cytK 18주, bceT 31주, CER 19주에서 양성의 증폭반응이 일어났고, 28주 non-B. cereus 균주들에서는 26주에서만 음성결과를 보였다. Non-B. cereus 대상균인 Bacillus thuringiensis 2주에서 cPCR과 real-time PCR 모두 hblC, nheA, entFM, bceT에서 특이적인 반응을 나타내었다. B. thuringiensis 중 일부는 장독소 유전자를 획득하여 장독소가 발현되는 경우 식중독을 유발할 수 있다고 보고되었다29-32). 또한 Rivera 등33)의 연구에서도 74개 B. thuringiensis에서 모두 nhe를 가지고 있으며, 일부 균주에서 hblC, bceT 유 전자를 가지고 있다고 하였으며, Hansen 등34)B. thuringiensis에서 hbl A, C, Dnhe A, B, C를 확인하였 다고 보고한 바가 있다.

    S. aureus 89종을 대상으로 한 특이도 분석 결과에서도 8개 유전자에 대해 inclusivity및 exclusivity 모두 100%로 확인되었다. Kim 등14)은 본 연구에서 사용한 S. aureus ATCC 13565 (sea), ATCC 14458 (seb), ATCC 23235 (sed)에 대해 각각 sea, seb, sed 유전자를 확인한 바 있으며, 본 연구에서도 동일한 결과를 확인하였다.

    Real-time PCR 민감도 평가는 multiplexing 조건에서 S. aureus의 표적 유전자 8종인 sea, seb, sec, sed, seh 유전 자는 10 copies/μL 이며, see, seg, sei 유전자는 1 copy/μL 였다. B. cereus의 6개 표적유전자 모두 10 copies/μL까지 검출이 가능하였다. 또한 이 때의 R2값은 0.997이상 수준 을 나타내었다(Table 3).

    cPCR과 real-time PCR에서 민감도 비교

    순수배양액에서 각 표적유전자들에 대한 cPCR과realtime PCR을 이용하여 검출한계를 비교했을 때, target에 따라 차이를 보였다(Table 4, 5). 검출 범위는 S. aureus의 경우 cPCR은 104-106 CFU/mL이며, real-time PCR은 103- 106 CFU/mL이었다. B. cereus는 cPCR (103-105 CFU/mL) 이고, real-time PCR (102-105 CFU/mL) 수준으로 검출되 었다. 대체적으로 real-time PCR법이 cPCR법 보다 10배 이상 높은 민감도를 보였다.

    즉석섭취식품에서 cPCR과 real-time PCR의 검출한계 비교

    식품에서 검출한계를 알아보고자 인위적으로 즉석섭취 식품에 대상균을 오염시켜 cPCR과 real-time PCR 시험을 수행한 결과 Table 6, 7과 같이 검출되었다.

    S. aureus에 대한 검출한계는 cPCR과 real-time PCR 모두 104-106 CFU/mL 범위를 나타내었고, B. cereus 는 cPCR과 real-time PCR 모두103-105 CFU/mL 검출 범위를 보였다. 순 수배양액과 식품에서 검출한계는 각각의 유전자에 따라 차 이는 있었지만 대체적으로 real-time PCR법이 민감도가 높 은 경향을 보였는데, 이는 전기영동에 의하여 분석하는 cPCR 과 형광강도로 분석하는 real-time PCR기법의 민감도 차이 때문임을 확인하였다35). 또한 real-time PCR의 검출효율성 은 다른 선행연구에서도 보고된 바 있다36). Kim 등37)Vibrio vulnificus ToxR gene을 대상으로 cPCR과 real-time PCR을 실시한 결과 민감도는 각각 5×103 copies/μL와 5copies/μL 이었고, Kim 등38)의 연구에서도 Listeria monocytogenes를 대상으로 cPCR과 real-time PCR을 실시한 결과 순수 배양액의 검출한계가 각각 7.2×103 CFU/mL, 7.2 ×102 CFU/mL으로 나타나 본 연구와 같이 real-time PCR의 민감도가 높은 것으로 나타났다. 이처럼 PCR 기법은 유전 자를 증폭시켜 적은 양의 DNA로도 식중독균 타겟 유전자 의 검출이 가능하기 때문에 병원성 미생물의 신속 검출에 활용되고 있다. 또한 배지법과 비교 시 그 효율성이 매우 뛰어나 PCR 기법을 기초로 한 신속한 검출 방법에 대한 연 구결과들이 다양한 분야에서 보고되고 있다39,40).

    이러한 연구 결과를 종합하여 볼 때, PCR은 선행 연구 에서 보고한 바와 같이 식중독 세균을 보다 신속하게 검출 할 수 있는 우수한 검출 기법인 것으로 판단된다. 검출능 력은 두 시험법 모두 Guillermo 등41)에서 보고한 PCR 검 출 수준인 103 CFU/mL 농도 이상에서 검출되었고, S. aureus (sed)와 B. cereus (nheA) 유전자를 제외한 대부분의 유전자 에 대해 cPCR보다 real-time PCR이 동등이상의 민감도를 나타내었다. 또한 real-time PCR은 유전자 증폭반응 이후 전기영동 과정이 필요하지 않기 때문에 conventional PCR 보다 효율적인 방법으로 사료된다.

    국문요약

    Staphylococcus aureusBacillus cereus는 식중독을 일 으키는 주요한 원인균 중 하나로 각종 식품에서 검출되면 서 많은 주의가 요구되고 있다. 식중독 발생의 원인균을 신속하고 정확하게 검출할 수 있는 여러 가지 방법 중 DNA 분석을 기반으로 하는 PCR 검출법이 보편적으로 사 용되고 있다. 본 연구에서는 샌드위치와 같은 즉석 섭취 식품에서 식중독을 유발할 수 있는 S. aureusB. cereus 의 신속검출을 위해 conventional PCR과 real-time PCR의 특이도 및 민감도를 비교하였다. 그 결과, 검출한계 범위가 배양액에서는 cPCR의 경우 S. aureus (104-106 CFU/mL), B. cereus (103-105 CFU/mL) 이였고, real-time PCR의 경우 S. aureus (103-106 CFU/mL), B. cereus (102-105 CFU/mL) 이였 다. 식품에서는 cPCR의 경우 S. aureus (104-106 CFU/mL), B. cereus (103-105 CFU/mL) 이고, real-time PCR의 경우 S. aureus (104-106 CFU/mL), B. cereus (103-105 CFU/mL) 으로 나타났다. Real-time PCR법이 cPCR법 보다 10배 이 상 더 민감한 것으로 나타났다. 따라서 real-time PCR은 우수한 민감도를 지닌 검출기법으로 식중독 세균 검출에 있어 매우 효과적인 방법으로 사료된다.

    Acknowledgments

    본 연구는 2017년도 식품의약품안전처 자체연구개발비 (16161위생안023)로 수행되었으며 이에 감사드립니다.

    Figure

    Table

    Specificity between cPCR and real-time PCR assay for the detection of Bacillus cereus

    Specificity between cPCR and real-time PCR assay for the detection of Staphylococcus aureus

    The limit of detection (LOD) of the real-time PCR for toxigenic genes of Staphylococcus aureus and Bacillus cereus

    Comparison of the limit of detection of cPCR and real-time PCR assay in Staphylococcus aureus cultures

    Comparison of the limit of detection of cPCR and real-time PCR assay in Bacillus cereus cultures

    Comparison between cPCR and real-time PCR assay for the detection of Staphylococcus aureus in sandwich

    Comparison between cPCR and real-time PCR assay for the detection of Bacillus cereus in sandwich

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