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ISSN : 1229-1153(Print)
ISSN : 2465-9223(Online)
Journal of Food Hygiene and Safety Vol.36 No.5 pp.407-417
DOI : https://doi.org/10.13103/JFHS.2021.36.5.407

Occurrence of Fungal Contamination in Ginseng Sprout and Mycotoxigenic Potential

Jang Nam Choi, So soo Kim, Jung-Hye Choi, Seul Gi Baek, Jin Ju Park, Ja Yeong Jang, Jeong-Eun Hyun, Se-Ri Kim, Jeom-Soon Kim, Theresa Lee*
Microbial Safety Division, National Institute of Agricultural Sciences, Rural Development Administration, Wanju, Korea
* Correspondence to: Theresa Lee, Microbial Safety Division, Department of Agro-Food Safety & Crop Protection, National Institute of Agricultural Sciences, Rural Development Administration, Wanju 55365, Korea Tel: 82-63-238-3401, Fax: 82-63-238-3840 E.mail: tessyl1@korea.kr
August 20, 2021 September 24, 2021 October 8, 2021

Abstract


In order to investigate frequency of fungal contamination in ginseng sprout, we collected 18 types of retail ginseng sprouts and analyzed them. Overall frequency of fungal contamination ranged from 113.3 to 174.1% with the highest occurrence of Penicillium spp. Fungal detection rate was significantly higher in moss than in stem, leaf and root of ginseng sprout. Penicillium spp. occurred in leaf and stem with the highest incidence and Fusarium spp., in root. Among Penicillium spp. and Fusarium spp., P. olsonii and F. oxysporum were dominant, respectively. Nine Fusarium species, Aspergillus westerdijkiae, Aspergillusflavus, and 11 Penicillium species were identified by phylogenetic analysis. PCR screening of mycotoxigenic potential revealed that 19 out of 25 isolates tested were positive for respective mycotoxin biosynthetic gene. Two 2 A. flavus and 11 A. westerdijkiae isolates produced varying amount of aflatoxin or ochratoxin A in czapek yeast extract brothsome of which showed high levels of mycotoxin production. These results suggests a need for continuous monitoring and management program to control fungal contamination in the ginseng sprout production chain.



새싹삼의 곰팡이 발생과 독소생성능

최 장남, 김 소수, 최 정혜, 백 슬기, 박 진주, 장 자영, 현 정은, 김 세리, 김 점순, 이데 레사*
농촌진흥청 국립농업과학원 유해생물과

초록


    두릅나무과 인삼 속 식물로 알려진 인삼(Panax ginseng C. A. Mayer)은 약 2,000 여 년 전부터 동아시아 지역에 대표적인 약용작물로써 사용되어 왔으며1) 사포닌 성분을 통해 항산화, 항노화, 항피로, 항당뇨를 비롯 심혈관계 질 병예방 등 다양한 약리적 효능을 나타내는 우리나라의 대표적인 특용작물이다2-4). 그러나 인삼 재배는 다른 작 물에 비해 4-6년이라는 비교적 장기간의 재배시간과 노 력이 소요되고 다양한 병충해에 노출되는 등의 어려움이 있다3,5). 이러한 점을 보완 및 대체하고자 개발된 새싹삼 은 1년 정도 인삼묘포에서 재배한 묘삼을 전용 상토 또 는 수경재배시설에서 최소 7일부터 최대 2개월까지 단기 간 재배하여 수확한다5). 새싹삼은 연중 재배가 가능하고 잎부터 뿌리까지 모든 부위를 식용할 수 있을 뿐만 아니 라 잎에도 다양한 사포닌을 포함한 유효성분이 함유되어 있어 신선채소로써 소비가 증가하는 추세이다2,5,6).

    그동안 인삼에 대해 농약과 중금속 안전관리 기술들은 지속적으로 개발되었으나 생물학적 위해요소에 관한 연 구는 Shim 등7)의 연구를 제외하면 현재까지 미흡한 실 정이다. Shim 등7)은 시중에 유통중인 인삼 및 인삼 제품 들을 대상으로 미생물 오염도를 조사했는데 수삼에서 일 반세균 및 대장균군 오염도가 3.19-7.02 log CFU/g, 곰팡 이 오염도는 0.72-5.54 log CFU/g로 조사되어 백삼, 홍삼, 홍삼음료 보다 미생물 오염도가 가장 높은 것으로 보고 하였다. 새싹삼에서는 Chang 등6)이 신선채소 형태로의 새싹삼 유통 시 포장용기 및 청이끼 사용에 따른 곰팡이 및 이취 발생 등의 품질저하를 개선하기 위해 적정 포장 용 필름 및 가스 사용에 관한 연구를 보고 하였다.

    안전한 농산물에 대한 소비자의 인식은 농산물의 생산 및 유통과정 중 농약의 위험성보다 생물학적 오염을 더 염려하고 있는 것으로 보고되었다7). 이러한 점에서 새싹 삼은 주로 생식으로 소비되고 있지만 현재까지 국내 새 싹삼 생산 환경에 맞는 위생관리기준이 충분히 마련되어 있지 않기 때문에 무엇보다 미생물학적 위생관리가 필요 하다. 따라서 본 연구에서는 향후 새싹삼의 안전 위생 관 리 기술 개발을 위한 기초자료로 활용하기 위해 국내 유 통중인 새싹삼의 곰팡이 오염 현황을 조사하였다.

    Materials and Methods

    시료 수집

    본 연구에 사용된 새싹삼은 국내 재배 농가 18곳에서 2021년 4월에 구입하였다(Table 1). 각 새싹삼 시료는 1 년생 묘삼으로 재배한 새싹삼 30뿌리 이상의 포장 제품 이었으며 받은 즉시 실험에 사용하였다.

    곰팡이 발생 조사

    새싹삼의 곰팡이 조사를 위해 새싹삼을 각각 잎, 줄4 기, 뿌리로 구분하여 각각 5×5 mm2 크기로 절단하였다. 흙이 묻어 있는 뿌리는 흐르는 물에 1분 간 세척한 후 페이퍼타월로 물기를 제거하고 절단하였다. 절단된 각 부 위 별 시료들은 감자한천배지(Potato Dextrose agar, PDA) 에 무작위로 30 조각씩 치상하였고 이를 25°C에서 5일 간 배양한 뒤 각 조각에서 확인된 곰팡이 균총을 계수하 였다. 곰팡이발생빈도는 다음과 같이 백분율로 나타내었다 : 곰팡이발생빈도(%) = (발생 곰팡이 균총 수/30 조각) × 100(Fig. 1). 추가적으로 새싹삼 유통 시 관상 및 수분 공 급 목적으로 사용되는 이끼는 무작위로 5 시료를 선정하 여 새싹삼과 같은 방법으로 치상하고 발생 곰팡이를 조 사하였다.

    주요 곰팡이 속 균 동정과 계통발생학적 분석

    곰팡이의 동정을 위해 균총 색, 형태, 포자의 특징을 실체현미경(DMC2900, Leica Microsystems Co., Wetzlar, Germany)으로 관찰하였으며, TEF-1α (Translation elongation fator-1 alpha), ITS (Internal Transcribed Spacer)과 BT (β-tublin) 영역을 증폭하여(C1000 Thermal cycler, Bio-Rad, CA, USA)8) 마크로젠(Macrogen, Seoul, Korea)에 각 PCR product의 염기서열 분석을 의뢰하였고 NCBI (National center for biotechnology information) BLAST search를 통해 일차 동정하였다.

    새싹삼에 발생한 균총 중 주요 독성 곰팡이 그룹의 계 통발생학적 분석을 위해 Fusarium spp., Penicillium spp., Aspergillus spp. 속의 배양적 특징이 보이는 균주와 독성 종 균주를 분리한 후 각 시료와 부위별로 무작위 1점씩 을 각각 대표 균주로 선발하였다. Fusarium spp. 균주는 TEF-1α (634 bp)와 RPB2 (RNA polymerase II) (860bp), Pencillim spp.과 Aspergillus spp.은 BT (590 bp)와 ITS (700 bp) 두 유전자를 조합하여 유연관계를 분석하고 최 종 동정하였다9,10). 각 염기서열은 Seqman Pro 15 program (DNASTAR, Inc., Madison, WI, USA)을 이용하여 분석 하였고 CLUSTAL W11)로 정렬하였으며 MEGA v10.0 program12)을 이용하였다. Bootstrap 분석은 1,000반복으로 수행하였다.

    분리 곰팡이의 독소형 확인과 독소 생성능 분석

    새싹삼에서 분리한 주요 독성 곰팡이 종을 대상으로 기존에 보고된 방법으로 생성가능 독소형을 조사하였다. Aflatoxin 생성에 관여하는 norB-cypA 유전자 증폭을 위 해 AP1729/AP3551 primer를 사용하였으며13), ohcratoxin 과 citrinin은 polyketide 유전자를 AoLC35-12L/R primer 를 사용하여 증폭하였다14). Patulin 생성 관여 유전자인 idh 유전자는 pexp IDH-F/R primer를 사용하였으며15) fumonisin 생성의 필수인 FUM1 유전자는 rp32/33 primer 를 사용하여 확인하였다16).

    독소 생성능 분석은 Aflatoxin과 ochratoxin A 독소형 이 확인된 A. flavusA. westerdijkiae 분리균주를 대상 으로 하였으며 각 독소 분석을 위한 전처리는 식품공전 시험법17)을 기준으로 수행하였다. A. flavus 균주는 Czapek yeast extract broth (CYB)에 25°C에서 14일 간 진탕배양하 였으며 이를 여과한 시료 1 mL에 70% MeOH 12 mL을 넣 고 10분 동안 초음파 추출(WUC-D10H, Daihan Scientific. Co., Ltd., Wonju, Korea)하여 3600 rpm으로 10 분간 원 심분리(1580MGR, Gyrozen Co., Ltd., Seoul, Korea)하였 다. 이 상층액 8 mL에 1% Tween 20 용액을 혼합하여 Aflatoxin 전용 면역친화성컬럼(AflaTest, Vicam, Co., Watertown, MA, USA)에 정제하였다. 이후 물로 세척하 고 칼럼 내 용액을 감압펌프로 제거한 후 acetonitrile (ACN) 2 mL로 용출하여 질소로 건조시켰다. 건조 후 잔 류물에 trifluoroacetic acid 0.2 mL를 넣고 15 분간 암실 방치 후, 20% ACN 0.8 mL을 넣고 0.2 μm syringe filter (PTFE 13 mm, RDtech. Inc., Quebec, Canada)로 여과한 후 분석에 사용하였다. Ochratoxin A 분석을 위해서는 A. westerdijkiae 분리균주의 CYB 배양액 1 mL에 10 mL 추 출용매(MeOH : 3% NaHCO3=50 : 50)을 혼합하여 위에 기술한 aflatoxin과 동일하게 10 분간 초음파 추출한 뒤 3600 rpm으로 10 분간 원심분리한 여액 3 mL과 3% NaHCO3 9 mL을 혼합하였다. 페닐실란 고상추출컬럼 (Phenyl silane solid phase extract column) (J.T. Baker Co., Philipsburg, NJ, USA)에 MeOH 10 mL과 3% NaHCO3 5 mL 주입하여 활성화한 뒤, 정제추출액 10 mL 을 주입하고 3% NaHCO3 10 mL로 컬럼을 세척한 후, 7% MeOH로 용출하였다. 이 용출액에 phosphate buffered salined (PBS) 5 mL을 넣고 ochratoxin A 전용 면역친화 성컬럼(OchraTest, Vicam, Co., Watertown, MA, USA)에 주입한 뒤, 0.01% tween 20이 함유된 PBS 5 mL과 증류 수를 차례로 주입하여 컬럼 세척 후 여액을 제거하였다. 이후, MeOH 2 mL로 용출한 용액을 질소로 건조시킨 뒤 잔류물에 ACN : 1% acetic acid (50 : 50, v/v) 혼합용액 1 mL을 가하여 녹인 후, 0.2 μm syringe filter로 여과한 용액을 분석에 사용하였다. 분석장비는 ultra performance liquid chromatography (UPLC) (Acquity, Waters, Milford, MA, USA)를 사용하였으며 Table 2의 조건으로 분석을 수행하였다.

    통계 분석

    모든 실험은 3반복으로 수행하였으며 실험 결과는 SAS (ver. 9.0, SAS Institute INC., Cary, NC, USA) 프로그램 을 이용하여 5% 유의수준에서 Duncan’s multiple range test로 비교 분석을 실시하였다.

    Results and Discussion

    새싹삼의 곰팡이 발생

    새싹삼 전체 시료에서 곰팡이는 평균 113.3-174.1%로 100% 이상의 높은 빈도로 발생하였다(Table 3). 우점 곰팡 이속은 Penicillium spp. > Fusarium spp. > Cladosporium spp. > Alternaeria spp. > Aspergillus spp. 순이었으며 18 개의 시료 중 16개에서 Penicillium spp.의 발생빈도가 가 장 높았다. 총균수나 Penicillium spp.의 발생 빈도는 각 시료의 지역 또는 재배방법과 연관성을 보이지 않았다.

    새싹삼을 부위 별로 구분하였을 때 총곰팡이 균수는 줄기 > 잎 > 뿌리 순으로 높게 나타났다(Table 4). 잎과 줄기에서는 Penicillium spp. 발생빈도가 각각 평균 72.9%, 61.7%로 다른 곰팡이 그룹(<20.7%)에 비해 월등히 높았 다. 반면, 뿌리에서는 Fusarium spp.이 30.3%로 가장 높 았으며 Penicillium spp.의 발생빈도는 14.6%로 잎과 줄 기와는 다른 양상을 보였다. 이끼에서는 총균수가 잎과 줄기, 뿌리의 총곰팡이 균수보다 유의하게 높았고 Penicillium spp. (34.7%) > Aspergillus spp. (25.3%) > Fusarium spp. (20.0%)의 순으로 발생하였으며 Aspergillus spp.은 새싹삼보다 높은 발생빈도를 보였다. 잎, 줄기, 이 끼에서는 Penicillium olsonii가 각각 30.0%, 28.3%, 20.0% 비율로 우점했으며 뿌리에서는 F. oxysporum (61.5%)이, 이끼에서는 A. aculeatus (26.7%)가 가장 많이 발생하였 다(Fig. 2). A. aculeatus는 포도의 초기 성숙단계에서 분 리된 균주가 ochratoxin A를 생성하였음이 보고되었다18).

    Penicillium spp.의 경우, 일반적으로 토양, 공기, 각종 유기물 속에 다양하게 존재하는데19) 새싹삼의 잎과 줄기 에 주요 우점 곰팡이로 확인된 P. olsonii의 경우, 국내에 서는 토양에서 분리된 보고가 있었고20), 국외에서는 토마 토 과실썩음병의 원인균으로 보고되기도 하였다21,22). 이 곰팡이는 다수의 포자를 생성하는 곰팡이의 특성 상 온 실 재배 시 공기중으로 전파가 용이한 것으로 알려져 있 다23). 따라서, 연중 재배되는 새싹삼에서 이 곰팡이가 만 연될 시 새싹삼 지상부에 다수 오염 가능성이 있다고 보 여지므로 추가적인 오염 경로를 규명할 필요가 있을 것 으로 사료된다. 새싹삼 유통에 주로 사용되는 이끼에서 의 곰팡이 총곰팡이 균수가 새싹삼보다 높았는데 이는 이끼의 위생관리가 필요함을 보여준다. 또한, 새싹삼의 우점종인 P. olsonii가 이끼에서 유래하는 것인지도 추가 연구가 필요하다.

    한편, 새싹삼의 뿌리에서 우점 곰팡이로 확인된 F. oxysporum은 대표적인 토양 전염성 곰팡이 중 하나로 시 설재배 시 관리 소홀 및 불량 환경 조건, 연작재배 등 발 생 원인이 다양하고 기주범위가 매우 넓은 것으로 알려 져 있다23,24). 또한, 인삼의 묘삼 생산 시에도 모잘록병, 뿌리썩음 등이 보고되었는데25) 외부로부터 묘삼 수급을 통한 새싹삼의 재배 환경을 고려해볼 때 묘삼의 수급 과 정에서 위생관리 검토가 필요한 것으로 보인다.

    주요 우점 곰팡이의 계통발생학적 분석

    새싹삼 시료에서 분리한 총 345개 곰팡이 균주 중 대 표적인 독성 곰팡이 속(genus)에 속하는 Fusarium spp. 49 균주, Penicillium spp. 39 균주, Aspergillus spp. 14 균 주를 대표 균주로 선발하여 각 그룹 내 유연관계를 분석 하였다. 7개의 Fusarium 종 복합체에 속하는 Fusarium 균주들은 모두 9개, Aspergillus는 2개, Pencillium은 11개 종이 동정 되었다. 이 중, 우점종인 F. oxysporum, A. westerdijkiae, P. olsonii 균주들은 종 내에서 대부분 각각 2개의 subgroup으로 구분되었으나 각 subgroup은 새싹삼 의 부위, 수집 지역, 농가 별 재배 방법에 따른 연관성은 보이지 않았다(Fig. 4-6).

    분리 곰팡이의 독소형과 독소생성능

    새싹삼에서 분리된 균주 중 곰팡이독소를 생성하는 것 으로 알려진 종(A. flavus, A. niger, A. westerdijkiae, F. asiaticum, P. chrysogenum, P. citrinum, P. expansum)에 속하는 균주는 총 25점이었으며 이들 균주를 대상으로 aflatoxin, ohcratoxin A, citrinin, patulin, nivalenol, fumonisin 독소의 생성가능성을 조사하였다(Table 5). A. flavus의 경우, 분리한 3점 균주 모두 aflatoxin 독소형으 로, A. westerdijkiae는 총 11점 균주 모두 ochratoxin A 독소형으로 확인되었다. F. asiaticum은 4점 모두 nivalenol 독소형으로 확인되었고 P. expansum은 2 균주 중 1점이 patulin 독소형인 것으로 확인되었다. A. niger, P. chrysogenumP. citrium은 모두 독소 유전자가 검출되 지 않았다. 독성곰팡이의 독소형이 확인된 균주는 총 25 균주 중 19 균주로 이는 새싹삼에서 분리한 전체 분리 균주의 약 5.5%가 곰팡이독소 생성능이 있음을 보여준 다. 이들 균주들은 주로 잎과 줄기에서 분리되었다.

    한편, A. flavus 균주 3점의 aflatoxin 독소생성능을 분 석한 결과, 3점 중 2점이 aflatoxin B1 (AFB1)과 aflatoxin B2 (AFB2)를 생성하였으며 aflatoxin G1 (AFG1)과 aflatoxin G2 (AFG2)는 검출되지 않았다. 이 중 GS-05-L1-1 균주는 9,105.7 μg/kg의 AFB1을 생성하였다. A. westerdijkiae는 11 점 균주 모두 1.8-2,500.1 μg/kg 범위의 ochratoxin A를 생성하였으며 특히, GS-06-6L-1과 GS-16-L2-2 균주는 2,000 μg/kg 이상을 생성하였다(Table 6). Wang 등28)A. flavus 균주의 총 aflatoxin 생성량이 12-5,120,000 μg/kg이었 음을 보고하였고 Okoth 등29)도 16-80,664 μg/kg 범위의 다 양한 aflatoxin 독소 생성을 보고하였다. Abarca 등30)은 식 품에서 분리한 ochratoxin A 생성 곰팡이의 배지 별 독소 생성능 연구에서 A. westerdijkiae가 CYB에서 0.4-12.9 ㎍/㎏ 범위의 ochratoxin A를 생성하였음을 보고하였다. 이들의 연구와 비교했을 때, 새싹삼에서 분리된 일부 균주가 높은 수준의 aflatoxin또는 ochratoxin A 독소생성능을 보유하고 있음을 알 수 있다. 곰팡이독소는 매우 적은 양으로도 인 축에 큰 피해를 주며 특히, 농산물에서 문제가 되고 있는 곰팡이독소들은 Fusarium, Aspergillus, Penicillium spp.의 곰 팡이들이 주로 분비한다26,27). 본 연구는 이들 독성 균주들 이 새싹삼에도 존재하며 환경에 따라 독소생성능이 다를 수 있음을 최초로 규명하였다. 향후, 새싹삼 생산에 있어 곰팡이 발생과 곰팡이독소 오염에 대한 지속적인 모니터 링과 관리 방안이 마련되어야 할 것이다.

    국문요약

    새싹삼의 곰팡이 발생을 조사하기 위해 18점의 유통중 인 새싹삼을 수집하여 곰팡이 발생빈도를 분석하였다. 전 체 시료의 총 곰팡이 발생빈도는 평균 113.3-174.1%였고 Penicillium spp.의 발생빈도가 가장 높았다. 곰팡이 발생 빈도는 이끼가 잎, 줄기, 뿌리보다 유의하게 높았다. 잎 과 줄기에서는 Penicillium spp.이, 뿌리에서는 Fusarium spp.의 발생이 높았으며 각각의 우점종은 P. olsoniiF. oxysporum으로 동정되었다. 계통발생학적 분석을 통해 Fusarium spp.은 총 9개 종, Aspergillus spp.은 A. westerdijkiaeA. favus, Penicillium spp.은 총 11개 종이 동정되었다. 곰팡이독소 생성 종으로 알려진 25균주의 독 소형을 PCR로 검정한 결과 19점의 균주에서 각 독소형 이 확인되었다. 이 중 A. flavus 2점과 A. westerdijkiae 11 점이 aflatoxin과 ochratoxin A을 각각 생성하였고 일부 균주는 높은 독소생성능을 보였다. 이 결과는 새싹삼 생 산에 있어 곰팡이 발생에 대한 지속적인 모니터링 및 관 리방안이 필요함을 시사하였다.

    Acknowledgement

    본 연구는 2021년 농촌진흥청 국립농업과학원 전문연 구원 과정 지원사업(과제번호: PJ01579003)에 의해 이루 어진 것임.

    Figure

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    Fungal colonies grown from the ginseng sprout in PDA plates after cultivation for 5 days at 25°C.

    JFHS-36-5-407_F2.gif

    Cultural (upper) and microscopic (lower) features of major fungal species isolated from the ginseng sprout after cultivation at 25°C for 7 days on PDA. A and D: Penicillium olsonii, branched conidiophores. B and E: Fusarium oxysporum, microconidia, C and F: Aspergillus aculeatus, conidial head (Magnification 400× by Leica DFC450C microscope and scale bar = 50 μm).

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    Frequency of fungal species contamination in leaf, stem, root of ginseng sprout and moss.

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    Neighbor joinging tree of Fusarium isolates from ginseng sprout. It was constructed by using combined sequences of TEF-1α and RPB2 gene (1360 bp) and the bootstrap values based on 1,000 replications. Cylindrocarpon destructans CBS 264.65 was used as an outgroup.

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    Neighbor joinging tree of Aspergillus isolates from ginseng sprout. It was constructed by using combined sequences of β-tublin and ITS gene (560 bp) and the bootstrap values based on 1,000 replications. A. welwitschiae CBS 139.54 was used an outgroup.

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    Neighbor joinging tree of Penicillium isolates from ginseng sprout. It was constructed by using combined sequences of β-tublin and ITS gene (900 bp) and the bootstrap values based on 1,000 replications. P. copticola CBS 127355 was used as an outgroup.

    Table

    List of ginseng sprout samples tested in this study

    UPLC analysis conditions used in this study

    Fungal frequency in ginseng sprout sample

    Fungal frequency in different parts of ginseng sprout and moss

    Mycotoxigenic potential of fungal isolates from ginseng sprout

    Aflatoxin and ochratoxin A production by Aspergillus flavus and A. westerdikijae isolates from ginseng sprout

    Reference

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