장염비브리오(Vibrio parahaemolyticus)는 그람음성 호염 성 간균으로 해양환경에 상재하는 세균이며, 오염된 어패 류를 생식하거나 수산물의 불충분한 가열 섭취에 의하여 발생하는 식중독의 원인균이다1,2). 장염비브리오는 해수온 도가 15°C 이상인 하절기에 증식하여 식중독을 일으키는 데, 주요 증상은 복통, 설사, 발열, 구토 등이 있으며 잠복 기는 4-96시간이다3,4). 식품의약품안전처 식중독 통계자료 에 따르면 2016년부터 2020년까지 5년간 장염비브리오에 의한 식중독 발생건수는 50건, 환자 수는 855명이었고, 월 별 발생현황을 보았을 때 여름철에 발생이 집중되어 있는 것으로 나타났다5). 또한 한국농촌경제연구원 식품수급표 에 따르면 한국의 연간 국민 1인당 수산물 공급량은 지속 적으로 증가하는 추세를 보이고 있으며, 특히 수산물을 생 식으로도 섭취하고 있어 수산물에 오염된 장염비브리오에 대한 지속적인 안전관리가 필요하다고 사료된다6).
장염비브리오의 주요 병원성 인자로는 내열성 용혈독 (thermostable direct hemolysin, TDH) 및 내열성 용혈독 관 련 용혈독(TDH-related hemolysin, TRH)이 있다3,7). TDH는 Wagatsuma blood agar에서 β-hemolysis를 나타내는 Kanagawa phenomenon (KP) 용혈현상과 관련된 독소이며, 장염비브리오 식중독 환자로부터 분리된 균주에서 확인되 는 독소이다3,8,9). TRH는 KP 음성인 균주에서 확인된 용 혈독으로 TDH와 유사한 용혈성을 나타내는 독소이며, 특 히 tdh 유전자와 trh 유전자는 68% 유전적 상동성을 나타 낸다고 보고되어 있다3,7,9,10). 역학조사에 따르면 임상에서 분리된 장염비브리오의 경우 대부분 tdh 유전자 및 trh 유 전자를 보유한 반면 자연 환경에서 분리된 균주는 0-6%만 tdh 유전자 및 trh 유전자를 보유하는 것으로 알려져 있다7-9,11).
한편 전 세계적으로 항생제 사용량이 증가함에 따라 항 생제에 내성을 나타내는 균주의 발생도 증가하고 있으며, 양식어류에서도 다양한 항생제에 내성을 나타내는 장염비 브리오가 증가하는 추세를 보이고 있다12,13). 또한 국가 항 생제 사용 및 내성 모니터링 보고서를 통해 한국에서의 수산용 의약품 판매량이 2015년부터 2017년까지 꾸준히 증가하였음을 알 수 있다14). 이에 따라 항생제의 사용으로 인해 병원성 세균 중 내성균의 발생이 증가하고 있어 지 속적인 모니터링이 필요한 실정이다. 따라서 본 연구에서 는 광주지역에 유통·판매되고 있는 수산물의 장염비브리 오 오염 정도를 확인하고, 분리된 균주의 독소유전자 보 유 및 항생제 내성을 조사하여 식중독 오염원 추적을 위 한 기초자료로 활용하고자 하였다.
Materials and Methods
시료 수집
2020년 1월부터 2020년 12월까지 총 27회에 걸쳐 광주 광역시 내 마트, 수산시장 등에서 유통·판매되고 있는 수 산물 총 335건을 구입하였으며, 시료는 구입 후 즉시 냉 장 상태로 운반하여 4시간 이내에 실험하였다. 실험대상 으로 한 수산물은 패류 163건, 어류 97건, 연체류 36건, 극피·척색류 26건, 갑각류 13건이었다.
장염비브리오 증균 및 분리배양
본 연구는 식중독 원인조사 시험법15)과 식품공전16)에 따 라 실험하였다. 시료 25 g에 증균배지 alkaline peptone water (Oxoid, Basingstoke, UK) 225 mL를 가하여 균질기(ES/ Masticator, IUL S.A, Barcelona, Spain)를 이용하여 균질화하 고, 36°C에서 18-24시간 배양하였다. 배양 후 EZ1 Advanced XL (Qiagen, Hilden, Germany) 장비에 EZ1 Virus Mini Kit v2.0 (Qiagen)를 이용하여 유전자를 추출하고, 7500 Fast Real- Time PCR System (Applied Biosystems, Waltham, MA, USA) 장비에 PowerChekTM 20 Pathogen Multiplex Real-time PCR Kit (Kogenebiotech, Seoul, Korea)를 이용하여 유전자 증폭 및 장염비브리오 유무를 확인하였다. PCR은 제조사 시험법에 따라 50°C에서 2분 후, 95°C에서 10분 반응시키고, 95°C 15초, 60°C 1분을 1 cycle로 하여 40 cycle 반복하여 실시하였다. 실험 결과 장염비브리오 유전자가 확인된 시료 의 배양액을 CHROMagarTM Vibrio (CHROMagar Microbiology, Paris, France)에 접종하여 36°C에서 18-24시간 배양 후 전형 적인 집락을 선별하여 1% NaCl이 첨가된 tryptone soy agar (TSA, Oxoid)에 계대 후 36°C에서 18-24시간 배양하였다. 배 양한 균은 VITEK 2 COMPACT (bioMérieux, Marcy l’Etoile, France) 장비에 VITEK 2 GN card (bioMérieux)를 이용하여 생화학적 방법으로 최종 동정하였다. 최종 확인된 장염비브 리오는 -70°C에서 보관하며 실험에 사용하였다.
장염비브리오 독소유전자 확인
분리 보관된 장염비브리오를 1% NaCl이 첨가된 TSA에 획선 도말하여 36°C에서 24시간 계대배양하였다. 순수분 리한 장염비브리오 집락을 취하여 멸균증류수 1 mL에 적 당량을 부유시켜 100°C에서 10분 처리한 후 13,000 rpm에 서 3분간 원심분리한 상층액을 주형 DNA로 사용하였다. 7500 Fast Real-Time PCR System 장비에 PowerChekTMVibrio parahaemolyticus Multiplex Real-time PCR Kit (Kogenebiotech)를 이용하여 유전자 증폭 및 유전적 특성 을 분석하였다. PCR은 제조사 시험법에 따라 50°C에서 2 분 후, 95°C에서 10분 반응시키고, 95°C 15초, 60°C 1분 을 1 cycle로 하여 35 cycle 반복하여 실시하였다. 분석 결 과는 Ct값 33이하에서 증폭이 일어났을 경우 독소유전자 가 검출된 것으로 판정하였다.
장염비브리오 항생제 내성 확인
순수 분리한 장염비브리오를 1% NaCl이 첨가된 TSA에 서 36°C, 18-24시간 배양하여 실험하였다. 장염비브리오 집락을 취하여 0.45% saline 3 mL에 부유시켜 MacFarland 0.6으로 조정하고, 조정한 액 145 μL를 0.45% saline 3 mL 에 주입하여 균질화한 용액으로 VITEK 2 COMPACT 장 비에 AST-N169 card (bioMérieux)를 이용하여 항생제 내 성을 확인하였다.
조사한 항생제는 12종으로 ampicillin, ampicillin/sulbactam, amoxicillin/clavulanic acid, amikacin, cefazolin, cefoxitin, chloramphenicol, ciprofloxacin, gentamicin, imipenem, tetracycline, trimethoprim/sulfamethoxazole 이었다. 실험 결 과는 Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)17) 에 따라 판정하였다.
Results and Discussion
장염비브리오 분리 현황 및 유전적 특성
수산물의 분기별 시료건수, 장염비브리오 검출건수 및 검출률은 Table 1에 나타내었다. 광주지역에서 유통·판매 되고 있는 수산물 335건 중 총 123건(36.7%)에서 장염비 브리오가 분리되었다. 분기별 시료건수 및 검출건수를 확 인하였을 때, 1분기(1월-3월) 때 검출률 3.6%에서 2분기(4 월-6월) 33.3%, 3분기(7월-9월) 64.0%까지 검출률이 증가 하다가 4분기(10월-12월)에 38.9%로 검출률이 감소하는 경 향을 나타내었다(Table 1). Lee 등18)은 가락시장, 노량진시 장 및 대형유통점의 수산물에서 채취된 1,143건 시료의 장 염비브리오 연중 분리율은 26.8%였고 월별 분리율은 1월 1.4%, 2, 3, 4월 각각 0.0%, 6월 35.8%, 7월 30.6%, 8월 53.6%, 9월 64.9%, 10월 45.8%, 11월 16.9%, 12월 15.2% 라고 보고하여, 본 연구와 유사한 경향을 나타내었다. Park 등19)은 경남 연안에서 2013-2016년 동안 채취한 해수 348 개 시료 중 42개 시료(12.1%)에서 장염비브리오가 검출되 었으며, 월별 검출률은 8월에 38.7%로 가장 높고 9월 (35.5%) 및 7월(22.6%) 순이었고, 특히 12월에서 다음해 5월까지는 전혀 검출되지 않았다고 보고하였다. 이는 1분 기(1월-3월)에 장염비브리오의 검출률이 3.6%로 나타난 본 연구와는 다소 차이를 나타낸 결과이다. Jeong 등20)에 따 르면 장염비브리오의 분포와 수온, 염도 등 해양환경인자 간의 상관관계를 조사하였을 때, 수온과의 상관계수가 0.916으로 매우 높은 양의 상관관계를 갖는 것이 확인되 었다고 하였다. 따라서 최근 기후 변화에 따른 바닷물 온 도 상승 등의 환경적 요인으로 인해 장염비브리오의 검출 시기가 빨라지고 검출건수도 증가하는 추세를 보이는 것 으로 사료되며, 이에 따라 장염비브리오에 대한 연중 지 속적인 모니터링이 필요할 것으로 사료된다21).
한편 수산물을 품목별로 구분한 시료건수, 장염비브리오 검출건수 및 검출률은 Table 2에 나타내었다. 건수가 가장 많은 품목은 패류로, 163건 중 73건에서 장염비브리오가 검출되어 검출률이 44.8%로 나타났다(Table 2). 어류는 97 건 중 16건에서 장염비브리오가 검출되어 검출률이 16.5% 로 나타나 수산물 품목 중 가장 낮은 검출률을 보였다 (Table 2). 반면 갑각류는 13건 중 10건에서 장염비브리오 가 검출되어 검출률이 76.9%로 수산물 품목 중 가장 높 은 검출률을 보였다(Table 2). Park 등19)에 따르면 경남 연 안에서 채취한 패류 366개 시료 중 80개 시료(21.9%)에서 장염비브리오가 검출되었다. Yoon 등22)은 남해안 어패류 843개 시료 중 138개 시료(16.4%)에서 장염비브리오가 검 출되었고, 조개에서 23.6%로 검출률이 가장 높았다고 보 고하여 본 연구의 장염비브리오 검출률과 다소 차이를 보 였다. 외국의 경우, 중국에서 Yang 등23)이 491건의 수산물 중 장염비브리오 164균주를 분리하여 검출률은 33.4%이 며, 수산물 품목별로는 어류 197건 중 58균주(29.4%), 패 류 102건 중 43균주(42.2%), 갑각류 120건 중 50균주 (41.7%), 연체류 29건 중 7균주(24.1%), 해조류 43건 중 6 균주(14.0%)가 분리되었다고 보고하였다. Wong 등24)은 베 트남, 홍콩 등 아시아 국가에서 대만으로 수입된 수산물 을 조사한 결과 총 686건의 수산물 중 315건에서 장염비 브리오가 검출되어 검출률은 45.9% 이었다고 보고한 바 있다. 특히 새우에서 75.8%, 게에서 73.3%로 다른 품목의 수산물에 비해 높은 검출률을 나타냈다고 보고하여 본 연 구에서의 갑각류의 장염비브리오 검출률과 유사하였다.
독소유전자 확인
335건의 수산물에서 분리된 장염비브리오 123균주를 대 상으로 real-time PCR을 이용하여 장염비브리오의 병원성 유전자인 toxR 유전자와 독소유전자인 tdh 유전자 및 trh 유전자의 보유여부를 확인하였고, 그 결과는 Table 3에 나 타내었다. 독소유전자 보유여부를 확인한 결과 123균주 모 두에서 toxR 유전자가 검출되었다(Table 3). toxR 유전자 는 PCR을 이용한 장염비브리오의 검출 확인을 위한 특이 유전자로 보고되어 있어 본 연구에서 분리된 123균주 모 두 장염비브리오인 것을 재확인하였다25). 독소유전자인 tdh 유전자는 모든 균주에서 검출되지 않았으며, trh 유전자는 3균주(2.4%)에서 검출되었다(Table 3). trh 유전자가 검출 된 수산물은 7월에 구입한 바지락 1건, 8월에 구입한 새 우 1건 및 11월에 구입한 굴 1건이었다(Table 3). 이전 연 구들에 따르면 환자에서 분리된 장염비브리오에서 tdh 유 전자 및 trh 유전자가 높은 비율로 검출되는 것과 달리 환 경 및 수산물에서 분리된 장염비브리오에서는 검출되는 비율이 매우 낮은 것으로 보고되어 있다9,26). Park 등27)에 따르면 2013년부터 2015년까지 남해안 패류양식장에서 채 취한 패류에서 분리한 장염비브리오 84균주 중 tdh 유전자 는 2균주(2.4%)에서, tdh 유전자는 8균주(9.5%)에서 검출되 었다. Kim 등28)은 2014년부터 2015년까지 채취한 양식 굴 에서 분리한 장염비브리오 115균주 중 tdh 유전자를 보유한 균주는 없었고, tdh 유전자를 보유한 균주는 11균주(9.6%)로 나타났다고 보고하여, 본 연구 결과에 비해 다소 높은 보유 율을 나타내었다. 한편, Robert-Pillot 등29)에 따르면 아시아, 아프리카, 남아메리카에서 프랑스로 수입된 수산물에서 분 리된 장염비브리오 130균주 중 tdh 유전자만 검출된 균주가 1균주(0.8%), tdh 유전자 및 trh 유전자가 같이 검출된 균주 가 1균주(0.8%)로, 나머지 128균주에서는 tdh 유전자 및 trh 유전자가 모두 검출되지 않아 본 연구에서 분리된 장염비 브리오의 독소유전자 보유율과 유사한 것을 확인할 수 있었다.
항생제 내성 특성
분리된 장염비브리오 123균주의 항생제 내성 실험 결과 는 Table 4 및 Table 5에 나타내었다. VITEK 2 system을 이용하여 분리된 균주를 대상으로 항생제 12종에 대한 내 성을 확인한 결과, ampicillin에 대해 내성을 나타낸 균주 가 116균주(94.3%)로 나타났다(Table 4). Trimethoprim/ sulfamethoxazole에 내성이 있는 균주는 1균주(0.8%)였고, 이 균주는 ampicillin에도 내성을 나타내어 항생제 2종에 모두 내성을 나타낸 다제내성균으로 확인되었다(Table 4). Cefoxitin과 ampicillin에 중등도 내성을 나타낸 균주는 각 각 12균주(9.8%), 5균주(4.1%)로 나타났다(Table 4). 이외 에 chloramphenicol, imipenem 및 tetracycline 등 9종의 항 생제에 대해서는 모든 균주가 감수성을 나타냈다(Table 4). 또한 수산물 품목별로 항생제 내성균주를 구분하여 보았 을 때 어류 및 연체류에서 분리된 29균주 모두 ampicillin 에 내성을 나타냈으며, trimethoprim/sulfamethoxazole에 내 성을 나타낸 균주는 8월에 구입한 민어에서 분리된 균주 임을 확인할 수 있었다(Table 5).
Lee 등18)은 어패류에서 분리된 장염비브리오가 ampicillin 에 대하여 100% 내성을 나타냈으며, chloramphenicol, tetracycline 등에는 100% 감수성을 보였다고 보고하였다. Yu 등30)은 굴에서 분리된 장염비브리오 균주 중 ampicillin 에 대한 내성균 비율이 79.1%, trimethoprim/sulfamethoxazole 에 대해서는 0.8%로 나타났으며, amoxicillin/clavulanic acid, amikacin 등에는 감수성을 나타냈다고 보고하였다. 한편, Ryu 등31)은 시판 어패류에서 분리된 장염비브리오 93주 모두가 2제 이상의 항생제에 내성을 나타내었으며, 특히 이 중 90주가 ampicillin을 포함한 2제 이상의 항생 제에 내성을 나타내었다고 보고하였다. Lopatek 등32)은 수 산물에서 분리된 장염비브리오 중 58균주(55.8%)가 2종류 이상의 항생제에 내성을 나타내었으며, 이 중 48균주(46.2%) 가 ampicillin과 streptomycin에 대한 내성을 나타냈다고 보 고한 바 있다. 이에 본 연구에서는 2종류 이상의 항생제 에 내성을 나타내는 균주가 1균주로 나타나 다제내성균의 비율이 매우 낮았으나, 이전 연구들에서 다제내성균의 비 율이 비교적 높고 전 세계적으로 항생제 사용량 증가에 따른 항생제 내성균에 대한 주의가 필요하다는 기존 연구 들을 고려하여 장염비브리오의 항생제 내성에 대한 지속 적인 모니터링이 필요할 것으로 사료된다12,13,33).
국문요약
본 연구에서는 광주광역시에 유통·판매되고 있는 수산물 을 대상으로 식중독 원인균인 장염비브리오의 검출여부와 분리된 균주의 독소 특성 및 항생제 내성에 대하여 조사 하였다. 패류 163건, 어류 97건 등을 포함하여 총 335건 의 수산물 중 123건(36.7%)에서 장염비브리오가 검출되었 다. 분리된 균주의 독소유전자 보유 여부를 확인한 결과 tdh 유전자는 모든 균주에서 검출되지 않았으며, trh 유전 자는 패류 2건 및 갑각류 1건에서 분리된 3균주(2.4%)에 서 검출되었다. 분리된 균주의 항생제 내성 실험 결과 116 균주(94.3%)가 ampicillin에 대해 내성을 나타냈으며, ampicillin과 trimethoprim/sulfamethoxazole 2종류에 모두 내성을 나타낸 균주는 민어에서 분리된 1균주(0.8%)로 확 인되었다. 이외에 amikacin, chloramphenicol 등을 포함한 9종의 항생제에 대해서는 모든 균주가 감수성을 나타낸 것으로 확인되었다. 따라서 본 연구 결과 광주지역 유통· 판매 수산물에서 분리된 장염비브리오의 독소유전자 보유 율 및 항생제 내성률은 비교적 낮으나, 환경적 요인에 의 한 장염비브리오의 검출률 증가 및 항생제 내성균에 대한 주의가 필요함에 따라 수산물에 대한 지속적인 모니터링 이 필요할 것으로 사료된다.
